Science重磅：冷冻电镜揭示世界上最大的疱疹病毒结构全貌（详细解读）

人类巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）是疱疹病毒科和β-疱疹病毒亚科的一员。它有着迄今为止所有疱疹病毒中最大的DNA基因组，可编码200多种蛋白质。当HCMV感染细胞后，会诱发宿主的在核周和胞质部分产生猫头鹰眼样的包涵体，从而使细胞变得肿胀巨大，因此得名为「巨细胞病毒」。

巨细胞病毒广泛存在，人和动物皆可遭受感染。其中能够感染人类的称为人巨细胞病毒HCMV，正式名为人疱疹病毒5型（human herpesvirus 5，HHV-5）。它往往会感染具有免疫缺陷的患者，例如胎儿、异种器官移植受者和艾滋病患者，近来的研究发现重症监护室的人、老年人和普通人群也会感染HCMV。其感染不像其他疱疹病毒那样会引起皮肤疾病，但可诱发内脏疾病，也可导致健康人的单核细胞增多症。HCMV的一个重要生物学特性是能够在宿主中建立终身潜伏性的感染，虽然大部分感染者是无症状的（人巨细胞病毒感染在我国非常广泛，一般人群的HCMV抗体阳性率为86%-96%，原发感染多在婴幼儿时期），但约20%患者可出现神经功能缺损。此外，HCMV原发感染或潜伏重新激活也往往是导致免疫功能低下患者发病和死亡的重要原因。

图1: 巨细胞病毒感染的细胞形态（图片来源：wikipedia）

疱疹病毒感染人体后都需要经历一个复杂的组装途径。在这个过程中，病毒DNA首先进入细胞核并被复制和封装在其中，然后通过劫持宿主的转录翻译途径在细胞质中获得成熟的病毒包膜。在病毒DNA复制和新形成的衣壳包装之后，包含基因组的衣壳必须穿过核膜，经过脱包膜的过程，到达细胞质中。因此，衣壳的结构对于其能否从病毒复制中心向细胞质出口起着决定性的作用，同样决定了后续疱疹病毒从细胞向外释放的过程是否能够顺利完成。

来自加州大学洛杉矶分校微生物学、免疫学和分子遗传学系的周正洪教授及其团队通过冷冻电镜技术探究了HCMV病毒的衣壳结构及其保护层pp150，为明确HCMV的原子结构提供了有力的证据。

与所有其他人类疱疹病毒相比，HCMV的基因组明显更大，且与其他疱疹病毒的层间距相比，HCMV的DNA层更加密集，层间距为~23-Å。HCMV衣壳结构由60个不对称单元组成，一个不对称单元包含16个主要衣壳蛋白（MCP），分别存在于五边形和六边形衣壳体（capsomer，对衣壳蛋白聚合结构的统称）中。六边形衣壳体还存在三种亚型，根据它们相对于衣壳二十面体对称的位置分别命名为C（中心）、P（周面）和E（边缘）。每个非对称单元包含一个C六边形、P六边形、1 / 2的E六边形和1 / 5的五边形。此外，五个三聚体（Ta, Tb, Tc, Td, Te和三分之一的Tf），以及pp150分子的16个拷贝，组合构成一个不对称单元（图2）。

图2: 主要衣壳蛋白（MCP）在病毒表面的排列形式

衣壳蛋白MCP全长1370个氨基酸，每个MCP被折叠成七个不同的域。MCP的结构域可以进一步组织成两个区域：一个塔区（它构成了五边形和六边形的衣壳体突起），一个底区。在衣壳体中相邻MCP塔区之间存在广泛的相互作用（图3）。大部分相互作用发生在较长且螺旋的邻近MCP上域的环状区域上，即HSV-1 MCP （VP5）上部结构域（称为VP5ud，upper domain）晶体结构。VP5ud是人巨细胞病毒唯一与其他疱疹病毒共有的一部分衣壳原子结构。VP5ud模型与HCMV MCP模型上域的结构比对显示，两者在二级和三级结构上高度相似，有丰富的螺旋，而环区域差距更明显。

图3: 衣壳蛋白在相邻MCP塔区之间存在广泛的相互作用

通道结构域呈六边形排列，其中来自一个MCP通道结构域的六条β链被来自相邻MCP通道结构域的另一条β链增强，形成一个朝向六边形通道内部的七股β链（图4A）。六个这样的β片聚集在一起形成一个β片环，通过每个β片的收缩环连接，构成六边形通道最窄的区域（图4B）。排列在六边形通道上的残基明显比下方的残基带更多的负电荷，而下方的残基总体上倾向于带正电荷（图4E）。这是因为下六边形通道是DNA容纳区，正残基相较负残基能更好地容纳带负电荷的DNA，从而减轻衣壳压力，提高衣壳的稳定性。

图4: 通道结构域的三维成像

在底区，三种显著类型的MCP-MCP相互作用有助于HCMV衣壳的结构完整性（图5）。I型相互作用是衣壳体内部发生在衣壳体内相邻MCP之间的相互作用，II型相互作用是导致衣壳体间发生二聚化的相互作用，III型相互作用则发生在三个MCP蛋白之间。MCP通过采用构象变化来适应衣壳形状在顶点的变化。在病毒衣壳中，有五边形和六边形的衣壳体。相对于六边形衣壳体，五边形具有更“封闭的伞形结构”，因此直径更小，但高度更高。五边形上缺乏II型和III型相互作用可能是疱疹病毒衣壳中五边形顶点易受攻击的原因。

图5: 发生在MCP底区的典型的三种衣壳相互作用

巨细胞衣壳蛋白除MCP五聚体和MCP六聚体之外的另一个成员，是由两种形成二聚体的Tri2蛋白Tri2A和Tri2B以及一个Tri1蛋白组成的异源三聚体。三聚体位于MCP N-lasso三角形的顶部，通过填充衣壳体之间底部的大空隙，在衣壳结构中发挥重要作用。Tri2的两个构象都有三个结构域：钳位（残基1至88）、主干（残基89-187和286-306）和拥抱臂（残基188-285），它们的命名也对应了它们在三元结构中的结构作用（图6）。

通过这些结构域，Tri2A和Tri2B相互“拥抱”形成一个大的螺旋束，将Tri2二聚体捆绑在一起。最后，衣壳层的三层MCP相互作用，由三个包含螺旋的支撑臂从三个相邻MCP的支撑域延伸出来，进一步夹紧三联体，同时为各自的MCP塔搭建一个额外的支撑点。三联体构成了锁单元的核心，每个MCP包含在两个锁单元中，并直接与四个锁单元交互，锁单元是一种衣壳组织模式，有助于说明结构蛋白的高度交织性质，这些结构蛋白聚集在一起构成HCMV衣壳。

图6: HCMV病毒衣壳的一个非对称单元的原子结构模型。从中可见MCP组织成的六聚体P，E和C衣壳体，五聚体衣壳体（右上角Penton MCP），Tri1，2A和2B构成的三聚体，以及更外层的保护蛋白pp150nt。

SCP是HCMV衣壳中最小的蛋白，与HSV-1不同的是，在HSV-1中，SCP只与六联体MCPs结合，而HCMV中的SCP同时与五边形和六联体MCPs结合，因此每个MCP只与一个SCP结合。五边形和六边形SCP都具有几乎相同的球状结构，并且都位于各自衣壳外周SCP上部结构域的顶部，与其底层MCP表现出相似的相互作用（图7A）。SCP的H3（残基57 -72）和c端环（残基73- 75）作为SCP与MCP之间的主要相互作用残基，插入MCP上域的间隙中（图7B）。

图7: SCP蛋白在衣壳上的组织形式

三个pp150分子-构象a, b和c 聚集在每个三联体上，并向三个附近的MCP的顶部延伸，形成网状的被膜密度层，从而包裹住HCMV衣壳。它主要是螺旋状的，一系列大致平行的螺旋排列在上下束中，由中央长螺旋连接。pp150nt和衣壳之间的相互作用发生在pp150nt的上端和下端，并保护了HCMV衣壳（图8）。其他人类疱疹病毒表现出仅与五边形和围五边形三联体结合，而pp150在HCMV中与所有衣壳体和三联体结合。这是因为HCMV中更大的压力来自于在同等大小的衣壳中包含一个实质上更大的基因组，这需要更强大的方法来稳定衣壳，而不是简单的五边形增强，所以需要招募pp150通过半胱氨酸四联体与SCP相互作用结合衣壳体突起（图8），从而稳定HCMV的衣壳结构。

图8: scp蛋白和pp150nt蛋白以较强大的互作策略稳定了衣壳结构

总结，在这样庞大的基因组包装压力下保持衣壳结构的完整性是疱疹病毒面临的巨大挑战，HCMV通过二十面体对称的1300-Å衣壳，使用一个巨大的MCP以建立衣壳，通过三联体异源三聚体来稳定其MCP，最后招募被膜蛋白pp150的螺旋捆绑衣壳，保护了其最外侧区域。自20世纪70年代以来，HCMV减毒活疫苗的开发方面收效甚微。通过构建HCMV的微观结构那能够更精确的、基于结构地开发有效的减毒活突变体，从而来发HCMV和潜在的其他疱疹病毒的疫苗。也同样提供了利用类似策略开发抗艾滋病毒疫苗的思路，这些发现将对开发针对HCMV和HIV感染的治疗干预新策略产生深远影响。

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