Current Biology发表文章，电子显微镜结构解析为细胞骨架研究送上“神助攻”

细胞骨架是细胞形态维持和功能实现的基础，而微丝（actin）则是细胞骨架的重要组成部分。微丝的动态组装和解聚对于细胞迁移、分裂、吞噬等过程至关重要。形成蛋白（formins）和解聚蛋白（severing proteins）是参与微丝动态调控的两类重要蛋白质。INF2 是一种独特的形成蛋白，它既能促进微丝组装，又能促进微丝解聚，但其解聚机制尚不清楚。

INF2 是一种特殊的微丝形成蛋白，它既能促进微丝组装，又能促进微丝解聚。INF2 的解聚活性需要微丝切割步骤，而微丝切割对于微丝动态调控至关重要。临床的遗传病研究发现，INF2 蛋白的突变会导致肾脏疾病和神经疾病，因此研究 INF2 导致微丝解聚的机制对于理解此类疾病的发生具有重要意义。

这篇由加州大学洛杉矶分校（UCLA）分子生物学研究所Henry N. Higgs团队与周正洪教授团队合作发表在 Current Biology 上的论文INF2-Mediated Severing through Actin Filament Encirclement and Disruption深入研究了 INF2 蛋白介导的微丝解聚机制，并与另一种已经被广泛研究解聚蛋白cofillin进行了比较。研究发现，INF2 通过其独特的结合结构和解聚方式，在微丝动态调控中发挥着重要作用。

为了研究 INF2 的解聚机制，研究人员采用了多种实验方法，包括：

双色全内反射荧光显微镜 （TIRF）: 用于实时观察 INF2 与微丝的结合和解聚过程。

凝胶过滤层析: 用于分析 INF2 与微丝的结合亲和力。

分析超速离心: 用于分析 INF2 蛋白质结构及其与微丝的结合状态。

负染电子显微镜与三维重构技术: 用于观察 INF2 与微丝的具体结合方式。

INF2 在整个微丝长度上进行切割

研究人员首先利用双色 TIRF 显微镜观察了 INF2 与微丝的结合和解聚过程。结果显示，INF2 并不在微丝末端进行切割，而是在整个微丝长度上进行切割（throughout），产生多个碎片。这与 cofillin 的解聚机制不同，后者主要在微丝末端（vectorial-pointed）进行切割。

不仅如此，随着INF2二聚体的数量增多，微丝上发生切割的频率持续增高，而非像cofillin一样先升高后降低。这提示INF2的切割判定机制和cofillin不同；cofillin在其“结合区”与“非结合区”的边界处通过不平衡性创造切割，而INF2很可能是独立的二聚体就具备对目标微丝区域去稳定的能力。

图1：研究人员通过生物化学和荧光显微镜方法确定INF2切割方式

INF2 与微丝的结合不受磷酸（ATP-ADP）

释放的影响

研究人员进一步研究发现，INF2 与微丝的结合不受磷酸释放的影响，即使在磷酸存在的情况下也能与微丝结合。这与 cofillin 不同，cofillin 与微丝的结合需要储存在微丝蛋白（actin）上的ATP水解为ADP+Pi，即磷酸释放。

INF2 与微丝的结合位点数量有限

TIRF 显微镜观察结果显示，INF2 在微丝上以离散的位点结合，而不是均匀地覆盖整个微丝。这表明 INF2 与微丝的结合具有一定的特异性。另外，INF2结合位点“切割”行为的发生（而非结合行为）已被证明是需要微丝蛋白上磷酸释放的。这导致，即使INF2的分布遍布整个微丝，其指导的切割行为仍然是靠近pointed end即微丝负极端（-）的。

图2：荧光显微和统计计数方法描述了INF2对微丝的切割行为

单个 INF2 二聚体足以切割微丝

大多数情况下，切割事件发生在 INF2 结合位点附近，并且发生在INF2结合之后。这表明 INF2 的结合是切割发生的前提条件。

荧光计数表明，单个INF2 二聚体就足以在结合位点切割微丝（图3A），而不需要大量的 INF2 蛋白分子协作。但实际上，INF2分子的结合与微丝发生切割的时间存在2～11s的延迟，第一次切割往往不发生在第一个结合位点，并且往往在一条微丝上结合了4-11个INF2二聚体的时候才发生第一次切割。接下来的几次切割发生的延迟更为明显（图3B）。然而，单个位点的切割仍然是由单个二聚体主导完成的，这与需要多个分子才能完成微丝切割的 cofillin 不同。

图3：对INF2结合与切割发生过程的定量分析

INF2 的 FH2 结构域

以环绕微丝而非贴近微丝的方式附着

INF2蛋白二聚体接近和结合微丝的方式似乎有两种：通过侧面贴附在微丝表面，或者像蟹钳那样“环抱”线性的微丝。这两种模型的重要区别在于，INF2二聚体是否能够以一定频率解聚和重新聚合。研究人员首先设计了超速离心方法进行分析：利用GFP荧光标记的INF2与微丝进行结合并对复合物进行超速离心，然后在另一组内加入大量未标记的INF2（分子质量更小）。

研究发现，INF2-微丝蛋白复合体的沉降系数由5.48S显著降低到了5.07S（图4C，绿线）。这一独特的发现似乎表明INF2的二聚体可以解开和再聚合，因此很有可能呈现出“环抱”微丝的独特结构。INF2二聚体不会与其他蛋白进行交换聚合。

图4：INF2二聚体可以解聚，并以特定的化学计量比与微丝相结合（多次试验证明）

为了更为清楚地分析INF2蛋白结合微丝的复合结构，研究人员通过负染色电子显微镜对INF2-微丝蛋白复合体进行了成像，并对电子密度图进行了螺旋3D重构，得到了分辨率20Å的分子轮廓图像。电子显微镜观察结果最终完全确定，INF2 的 FH2 结构域环绕微丝，并与微丝进行紧密结合。这种结合方式类似于其他形成蛋白，如 FMNL1 和 FMNL3。较为遗憾的是，负染色电子显微镜的较低分辨率让研究人员没能进一步区分结合方式为环层状的Concentric Dimers还是螺旋状的Daisy-Chain。

图5：对微丝纤维-INF2复合物的负染色电子显微镜三维重构

DAD 结构域增强 INF2 的切割活性

研究发现，DAD 结构域可以增强 INF2 的切割活性，使其比 cofillin 更有效地切割微丝。这表明 DAD 结构域在 INF2 的解聚活性中发挥着重要作用。

INF2 介导的微丝解聚模型

基于以上研究结果，研究人员提出了 INF2 介导的微丝解聚模型。

1、INF2 二聚体部分解离并环绕微丝：INF2 二聚体部分解离，然后环绕微丝，形成稳定的结合状态。

2、FH2 结构域引起微丝结构变化：FH2 结构域与微丝结合后，会引起微丝结构的变化，使其更容易被切割。

3、磷酸释放导致微丝结构进一步变化：磷酸释放会导致微丝结构进一步变化，使其更容易被切割。

4、DAD 结构域插入微丝：最后，DAD 结构域插入微丝，进一步破坏微丝结构，使其更容易解聚。

图6：INF2介导微丝切割的最终模型

这项研究揭示了 INF2 介导的微丝解聚机制，为理解微丝动态调控提供了重要的理论基础。同时，这项研究也为研究 INF2 突变引起的疾病提供了新的思路，并为开发治疗这些疾病的新药物提供了潜在的靶点。

负染色电子显微镜和根据电子密度图做出的螺旋三维重构（Helical 3D reconstruction）为揭示INF2蛋白在微丝上的结合情况和为该蛋白作用原理做出最终推断起到了决定性的作用。在使用传统细胞学方法发现INF2蛋白二聚体可以解开/聚合之后，研究人员选择“眼见为实”，使用电子成像直接确定实际结构，成功确定了INF2蛋白的独特结合方式，并进一步推断出了INF2蛋白导致微丝蛋白解聚的作用机制。

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