Cell子刊：冷冻电镜解密细胞分裂过程的分子基础

细胞分裂可以说是自古至今生物体最重要的生命过程之一。从细胞增殖、分化到物种的演化， 从单细胞动物过渡到多细胞动物，并形成由简单到复杂、由低等到高等的生命体，都始于一个个微小细胞的分裂。1879年，德国细胞学家弗莱明（W．Flemming,1843～1915）通过对蝾螈幼体尾鳍的上皮细胞和红细胞的观察，首先发现了在细胞核分裂时，被染色的细丝状物质（即后来称为的染色体）要纵裂为二，并分别移向两个子细胞这一重要的事实，进而推动了生物学界对有丝分裂的认识。

有丝分裂是真核细胞分裂产生体细胞的过程，细胞在分裂的过程中有纺锤体和染色体出现，使染色体被平均分配到子细胞，这种分裂方式普遍见于高等动植物。那么染色体是由何处被牵拉均分的呢？往往概括性地泛指染色体主缢痕位置的着丝粒，但事实上更精确一点来讲，真正附着着纺锤丝的是其上的动粒（kinetochore）。

动粒包含大量蛋白质，其中一类蛋白，一种组蛋白H3变种（称为“CENP-A”或“CenH3”），在动粒和DNA连接中起辅助作用。CENP-N在细胞分裂的S期（基因组复制期）被招募到着丝粒中，对含有CENP-A的染色质进行识别，是动粒组装功能性着丝点的关键步骤，从而在细胞分裂过程中实现准确的染色体分离。核小体DNA除了与CENP-A的RG环外，还与CENP-N直接接触，这表明CENP-N与DNA的相互作用在CENP-A核小体识别中可能起到重要作用。这种作用是如何进行的？

中国科学院结构生物学重点实验室的Jianye Zang 教授和美国加州大学洛杉矶分校微生物学、免疫学与分子遗传学学系的Z Hong Zhou教授带领团队通过冷冻电镜技术探究了其功能结构域的晶体结构及其相互作用模式。文章Molecular basis for CENP-N recognition of CENP-A nucleosome on the human kinetochore发表在Cell Research上。

为了阐明CENP-LN复合物特异性识别CENP-A NCP的分子基础，研究者重组了一个含有147bp DNA包裹的CENP-A NCP复合物和CENP-LN复合物，并通过冷冻电镜进行了结构研究。低温电镜结构的表面视图显示了NCP的结构特征，包括dsDNA的主要和次要凹槽(图1A)， CENP-A NCP中四个组蛋白的螺旋和连接环(图1B)。这种拟合还表明，在CENP-A NCP晶体结构中缺失的入口处和出口的13bp DNA在结构中被分解，并且表现出与典型H3核小体几乎相同的排列。

附着在NCP的一面是两个额外的突出密度区域——一个靠近NCP，另一个远离NCP——这是由结合的CENP-LN复合物导致的(图1A和1C)。近端密度区与NCP有广泛的接触(图1A)，而远端则没有相互作用。酵母Chl4C /Iml3的晶体结构可以嵌入远端密度区的包膜中，Chl4C的N端连接子位于近端和远端区域之间，表明近端密度区(图1C，橙色)可能对应于CENP-N的N端结构域。事实上，凝胶移位实验证实，CENP-N的N端片段的确可以结合CENP-A核小体并释放147 bp的DNA。

冷冻电镜还揭示了CENP-NN包含5个长(~20 Å)和1-3个短的(~13 Å) α-螺旋围绕着中心的β薄片，特别是在CENP-N和NCP之间。CENP-A NCP和CENP-NN之间覆盖了组蛋白和相邻的核小体DNA。除了之前关于CENP-A的RG环的报道外，该研究中的低温电镜结构提供了对其功能的结构见解，其中RG环与CENP-N的至少两个不同区域相互作用，其中一个位于螺旋的末端(图1D)。除了保守残基R80外，从结构上看，D83似乎还与CENP-N相互作用(图1D)。此外，通过化学交联结合质谱(XL-MS)鉴定， H2B c端螺旋的H109-K120残基是CENP-N的潜在结合区。该研究的结构表明H2BT119是该区域内最有可能参与CENP-N结合的残基(图1D)。

图1：CENP-N通过CENP-A和核小体DNA识别CENP-A核小体的结构

与CENP-A的RG环相比，很少有研究报道核小体DNA本身对CENP-N结合的贡献。而在低温电镜下令人惊讶的是，CENP-N和DNA之间的接触占据了一半以上。CENP-N与磷酸盐骨架沿着两个连续的小凹槽相互作用。核小体DNA上相互作用的磷酸骨架可分为+37/+ 36nt、-32 / - 31nt、+26/+ 25nt和-22 / - 21nt四组。这四个DNA位点与CENP-N的四个不同区域相互作用，形成一个大的DNA-蛋白交界面（图2），表明CENP-N-DNA相互作用在CENP-A NCP/CENP-LN复合物的形成和稳定中起重要作用。CENP-N通过与磷酸骨架相互作用以序列独立的方式识别核小体DNA，这表明CENP-N的带正电残基在DNA结合中起重要作用。

图2：冷冻电镜成像结合细胞学方法解释核小体DNA和CENP蛋白复合物的相互作用

为了进一步探究CENP-N在识别CENP-A时与DNA结合的作用，研究者首先通过对不同物种的CENP-N同源物的序列比对分析，将保守的带正电的氨基酸改为丙氨酸，产生了几个突变体，突变显著降低了CENP-A NCP与CENP-N的结合亲和力。

研究者继而将针对CENP-N的siRNA寡核苷酸引入HeLa细胞，并使用延时显微镜检查有丝分裂过程（图2）。发现抑制CENP-N导致染色体分离缺陷的频率增高，包括染色体错位和染色体桥。在缺乏CENP-N的细胞中发现的缺陷在很大程度上被抗RNAi的野生型CENP-N所修复，但没有被K10A(一种缺乏DNA结合的CENP-N突变体所修复，这些结果均表明了CENP-N的DNA结合活性在有丝分裂染色体运动中的作用。

该研究通过冷冻电镜揭示了CENP-N如何特异性识别含有CENP-A的染色质并招募CENP-L进行着丝点组装。CENP-N是CENP-A和CENP-L稳定结合所必需的，人类着丝点进化出的这种复杂的着丝点组装机制，可以确保在细胞分裂过程中染色体的精确分离。

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