Nature Communications揭秘TRPV5：钙稳态的“守门人”与内源性调节因子的互动奥秘

Cryo-EM解析了三种不同状态下的TRPV5的结构：脂质结合状态（在可能参与维持 TRPV5 结构的内源性脂质的存在下）、PI(4,5)P2结合状态（与内源性激活剂结合）和CaM结合状态（与内源性抑制剂结合）。

前两种状态探究PI(4,5)P2对TPRV5的相互作用，为了方便在体外进行实验和结构解析，研究人员用可溶性的PI(4,5)P2类似物，diC8 PI(4,5)P2来代替不易溶于水的脂质PI(4,5)P2。其中脂质结合状态为TRPV5在含有脂质的溶液中稳定存在的状态，此时TRPV5可能处于关闭状态或预开放状态；升高diC8 PI(4,5)P2浓度后将得到PI(4,5)P2结合状态，即TRPV5与PI(4,5)P2结合后激活的状态，此时TRPV5通道孔径打开，允许钙离子自由通过。

由于结合的脂质为非蛋白质成分，研究者使用一种图像处理方法，粒子减法，从Cryo-EM图像中移除该成分的影响，从而提高蛋白质结构的分辨率；为了获得更接近生理状态的蛋白质结构，研究者采用纳米圆盘，一种由磷脂双层包裹的蛋白质纳米结构，来捕获蛋白质与脂质的结合状态，稳定膜蛋白；得到3.9Å分辨率下的脂质结合TRPV5密度图如下。

图1：左为3.9Å分辨率下的脂质结合TRPV5密度图，右为左图的卡通表示（灰色、粉色表示TRPV5的密度，卡其色表示环形脂质的密度）

脂结合态的TRPV5如何发挥钙离子通道作用呢？其通道孔包含三个与孔道收缩相关的残基：Asp542、Ile575和Trp583，拍摄的图片密度清晰显示，高度特异性的钙离子选择性滤器的四个Asp542残基（TRPV5为四聚体）直接指向孔道，脱水钙离子无法通过；而Ile575 和 Trp583则没有将孔道收缩到阻塞离子转运的程度，这些残基组成的下门是开放的，允许离子通过。这也表明脂结合态TRPV5结构的孔道可能处于闭合-预开放构象。

图2：左为脂结合态TRPV5孔的卡通表示，右为该通道的孔半径与通过孔的距离的的函数图（右图虚线表示脱水钙离子的半径）

图3：左为放大后的TRPV5 PI(4,5) p2结合袋；右为中和PI(4,5)P2结合的关键残基会提高TRPV5对 Wortmannin的敏感性

比较这两种结合状态（分别为未开始激活和被激活状态），PI(4,5)P2结合态引发构象变化，导致活性改变：通道的孔径变宽，可允许水合的钙离子流动（下图c）；构成通道选择性滤器的 Asp542残基指向通道外腔，而不是像脂结合态中那样指向离子传导途径（下图d）；S6螺旋和Trp583移动，使通道的下部闸门也完全开放，从8 Å扩大到约12 Å（下图e）。

图4：脂结合态和PI(4,5)P2结合态的叠加比较（各图脂结合态均为粉红色，PI(4,5)P2结合态均为绿色）

此外，冷冻电镜下TRPV5两种结合态空间结构的对比，揭示了PI(4,5)P2结合引发的构象变化的微观细节。例如，磷酸基团与S6螺旋上的Arg584形成盐桥，导致S6螺旋延长和旋转；Trp583与Gln587相互作用，从而稳定其位置；静电作用进一步稳定diC8 PI(4,5)P2在其结合位点中的位置，这些微观变化最终导致S4-S5连接子外移、形成新相互作用、打开下门控区域等宏观结果。

图5：PI(4,5)P2结合态（左）和脂结合态（右）的TRPV5细节比较

总之，PI(4,5)P2通过与TRPV5特定位点结合导致氨基酸之间的相互作用改变，进而导致通道孔扩张，Asp542残基指向细胞外，下门完全开放，都将有利于钙离子通过，宏观表现为PI(4,5)P2对TRPV5重吸收钙的激活作用，促进钙离子的转运。

冷冻电镜结果显示，一个CaM分子结合在TRPV5通道基底部的孔道内，结合CaM的 TRPV5构象与脂结合态的TRPV5构象非常相似。在作用位点上，CaM的两个结构域分别与TRPV5的C端的不同区域结合：CaM的C端与TRPV5的C端片段结合，TRPV5的Trp702与CaM结合口袋形成关键接触；CaM的N端的疏水结合口袋则结合TRPV5的C端延伸片段形成的螺旋，该过程由多个疏水接触介导。

针对抑制作用的研究，CaM的C端孔道内的Lys116与Trp583残基之间形成阳离子-π相互作用，从而阻止钙离子通过孔道。分离的膜片钳实验验证了Trp583在CaM导致TRPV5失活过程中的作用至关重要。

以上研究表明，CaM通过与TRPV5的C端结合，并在下门控区域形成阳离子-π相互作用，宏观上来看，一个CaM分子的结合完全阻塞了孔道的细胞内侧，有效地阻止了离子通透，从而抑制通道的钙离子通透性。

图6：CaM 结合态的TRPV5密度图侧视图和底视图（a,b）、孔径图（c）、孔径半径随孔径距离变化的曲线图（d, CaM 结合态为蓝色，脂结合态为粉色，虚线表示钙离子的半径）

在研究TRPV5的过程中，冷冻电镜技术发挥了无可替代的关键作用。这项技术不仅能够捕捉并解析生物样品在接近生理状态下的高分辨率三维结构，还直接揭示了多个关键分子机制的细节。通过冷冻电镜的观察，研究人员不仅确定了几个高亲和力脂质的结合口袋，直接证明了PI(4,5)P2如何与TRPV5发生相互作用以及所导致的孔道构象变化，而且首次揭示了CaM如何抑制TRPV5中的离子流动。这些成果为一些TRPV亚家族通道的静态性质提供了更多证据，为理解离子通道的门控机制提供了强有力的证据，为TRPV通道家族的功能多样性增添了新的维度，也为相关疾病的治疗策略开发提供了新的思路。

冷冻电镜技术的蓬勃发展极大地推动了我们对蛋白质等生物大分子结构的深入认识。它不仅使蛋白质的结构解析变得更加高效和精确，还促进了生物学、物理学、化学以及计算机科学等多个学科的交叉融合，共同探索生命的奥秘。

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