Nat. Commun. | 几何图学习助力酶功能预测，中大杨跃东团队提出GraphEC模型

今天为大家介绍的是来自中山大学杨跃东团队的一篇论文。酶在众多生物过程中起着至关重要的作用，其中EC编号是定义酶功能的常用方法。然而，现有的EC编号预测技术并未充分认识到酶活性位点和结构特征的重要性。为此，作者提出了一种基于几何图学习的EC编号预测器——GraphEC，它使用ESMFold预测的结构和预训练的蛋白质语言模型。具体来说，作者首先构建了一个模型来预测酶的活性位点，并利用该模型来预测EC编号。通过引入同源信息的标签扩散算法（label diffusion algorithm），进一步提升了预测的准确性。同时，模型还预测了酶的最佳pH值，以反映酶催化反应的特性。实验表明，该模型在活性位点、EC编号及最佳pH值的预测方面，相较于其他先进方法具有更优表现。进一步的分析揭示，GraphEC能够从蛋白质结构中提取功能信息，强调了几何图学习的有效性。该技术可用于识别未注释的酶功能，并预测其活性位点和最佳pH值，具有推动合成生物学、基因组学等领域研究的潜力。

酶通过催化多种反应在各类生物过程中起着重要作用。识别酶的功能对代谢和疾病的研究具有重要意义。EC编号以四位数字的结构形式表达酶的功能，为酶工程领域提供统一的体系。然而，EC编号的实验测定过程耗时且成本高昂。因此，发展用于识别EC编号的计算方法变得尤为必要。

计算方法可以分为基于同源性、基于结构和基于机器学习的方法。基于同源性的方法假设高度相似的酶具有相似的功能，并利用比对工具对酶功能进行注释。这些方法主要依赖于序列相似性，但在缺乏相似序列时，其覆盖率有限。为提高覆盖率，基于结构的方法通过扫描结构相似的蛋白模板来识别一致的功能。例如，COFACTOR通过将查询结构与BioLiP库中已知结构和功能的蛋白质进行比较，以实现功能注释。尽管这些方法有所改进，但由于缺乏高质量模板，仍面临挑战。为了跳出相似序列和模板的限制，基于机器学习的方法应运而生。早期的机器学习方法先提取重要特征，再利用机器学习算法来识别相应的EC编号。然而，这些算法的性能高度依赖于人工设计的特征，难以适应不断扩展的酶序列。

近年来，深度学习方法在酶功能注释方面取得了成功。为避免人工特征提取，DEEPre利用CNN和RNN组件来捕捉卷积和序列特征。ProteInfer使用空洞（dilated）卷积网络来建立蛋白质空间与酶功能空间之间的映射。GrAPFI使用InterPro签名作为领域信息，在加权无向图上进行标签传播（label propagation）。CLEAN是另一种深度学习方法，通过对比学习获取丰富的嵌入特征，在EC编号识别中实现了更高的准确性和更广的EC覆盖范围。然而，这些方法仍存在两个局限性：第一，它们仅使用蛋白质序列而未结合蛋白质结构，从而失去了结构中隐含的重要特征；第二，它们未在酶功能分析中利用酶活性位点的关键信息。

由于缺乏天然结构，现有方法未能充分利用蛋白质结构中的信息。Lin等人提出了预训练语言模型ESMFold，用于精确且快速的结构预测，其准确性与AlphaFold2相当，但推理时间缩短了高达60倍。在ESMFold预测结构的帮助下，几何图学习可以高效提取结构信息，这一技术已在蛋白质设计和对接中证明了其优势。为了增强几何图学习，一些研究尝试使用无监督语言模型（如ProtTrans和ESM-1b）结合有用的序列嵌入信息。

另一方面，酶的活性位点通常位于酶的表面，在催化反应或结合底物中发挥重要作用。这些位点在进化过程中高度保守，对酶功能具有决定性影响。因此，在分配EC编号时，酶的活性位点意义很大。然而，当前用于预测酶活性位点的方法主要依赖模板或手工设计的特征，无法跟上迅速增长的数据，这凸显了对快速且准确的酶活性位点预测工具的需求。除了活性位点外，标签扩散算法也被开发用于蛋白质功能预测，可以转移功能相关的数据，辅助识别EC编号。

图 1

GraphEC是一种基于几何图学习的精准EC编号预测器，将酶的活性位点和预测的蛋白质结构整合到酶功能预测中（图1）。给定一个蛋白质序列，其结构由ESMFold预测并用于构建蛋白质图。几何特征通过预测结构提取，并通过预训练语言模型ProtTrans计算的序列嵌入进行增强。这些特征输入到几何图学习网络中，用于学习几何嵌入，并应用于活性位点、EC编号和最佳pH值的预测。GraphEC-AS首先预测酶的活性位点，并为每个残基分配权重分数。在这些权重分数的指导下，初步的EC编号预测通过注意力层和池化层计算得出，并通过提取同源信息的标签扩散算法进一步优化。最后，模型通过注意力池化扩展到最佳pH值的预测，以更好地表示反应条件（GraphEC-pH）。

图 2

作者首先评估了GraphEC-AS在独立测试集TS124上的残基级酶活性位点预测。图2A显示，GraphEC-AS在五折交叉验证中的AUC（ROC曲线下的面积）为0.9635，在TS124上的AUC为0.9583，表明该模型具有良好的稳健性。六种对比方法（PREvaIL_RF、PREvaIL_LR、CRpred（带坐标的残基）、CRpred（所有残基）、HA（残基身份筛选）、HA（组合筛选））的ROC曲线位于GraphEC-AS和BiLSTM（不包含结构信息的模型）之间，凸显了几何信息的重要性。

在MCC（Matthews相关系数）、召回率和精准度方面（图2B），GraphEC-AS始终表现最佳。排名第二的PREvaIL_RF分别取得了0.2939、0.6223和0.1487，较GraphEC-AS低40.9%、14.5%和57.1%。此外，GraphEC-AS在TS124上的F1得分为0.4698，而第二名的PREvaIL_RF得分为0.240，相比GraphEC-AS下降了48.9%。PREvaIL方法需要使用PSI-BLAST计算耗时的进化特征，而GraphEC-AS可以快速且准确地识别酶活性位点。

GraphEC-AS在TS124上的已学习特征结果上进一步展示了其优势。图2C中的ProtTrans嵌入分布较为分散，而GraphEC-AS学习的几何嵌入（图2D）则清晰地区分了活性位点和非活性位点。这表明几何图学习能够有效识别它们之间的关键差异。作者进一步使用TM-align评估了ESMFold预测结构质量对TS124的影响。超过85%的蛋白质TM-Score高于0.8，反映了ESMFold预测结构的高质量。AUC值随着TM-Score的增加而提升，这说明了高质量预测结构的重要性，并强调了使用ProtTrans增强特征嵌入的必要性。

图2E和图2F对比了BiLSTM和GraphEC-AS对同一个例子（顺式粘康酸环化酶）预测的三维结构。GraphEC-AS识别了所有四个活性位点，而BiLSTM仅检测到H149，因为其缺乏局部结构特征的识别能力。相比H149，其余活性位点在序列上距离较远（超过20个残基），但在结构上却相距较近（小于16 Å）。这些结果表明，GraphEC-AS能够学习局部结构信息。

在预测的活性位点指导下，GraphEC用于识别酶的EC编号。GraphEC在两个独立测试集NEW-392和Price-149上进行了评估，其中NEW-392包含392个酶序列，涵盖177个不同的EC编号，而Price-149是Price等人验证的实验数据集。与四种先进的EC编号预测器（包括CLEAN、ProteInfer、DeepEC、ECPred、GrAPFI和ECPICK）相比，GraphEC在多项指标上表现更佳。

图 3

图3A显示，GraphEC在Price-149上的AUC、召回率（recall）、精准度（precision）和F1分别为0.8404、0.6908、0.6132和0.6131，分别比表现第二好的CLEAN高出14.6%、47.9%、4.9%和23.9%。在NEW-392上，GraphEC在AUC（0.8910）、召回率（0.7988）和F1（0.5910）方面均取得最佳值。

GraphEC还在不同层级的EC编号和各EC编号在训练集中的出现频率上进行了评估。考虑到训练集中EC编号频率可能对模型性能的影响，作者在NEW-392上根据EC编号在训练集中出现的次数评估了精度（图3B）。超过66.0%的酶出现次数少于十次，只有8.9%的酶出现次数超过100次，显示出数据集的挑战性。正如预期，预测低频EC编号较为困难。然而，GraphEC在不同出现频率的EC编号上始终表现出较高的精度，突显了模型的优越性。

EC编号的四个数字分别对应酶功能分类的不同层级，第一至第四位数字代表逐级分解的功能层级。在NEW-392上，GraphEC相较于CLEAN的召回率分别在第一至第四层级提升了1.1%、1.7%、3.4%和66.0%，其召回率分别为0.9468、0.9116、0.8945和0.7988（图3C）。随着层级的增加，GraphEC的优势变得更加明显，表明了模型的有效性。

在EC编号预测中考虑活性位点的应用，作者评估了活性位点突变的影响。首先，作者基于预测结果（得分> 0.5）识别了NEW-392和Price-149中的酶活性位点。随后，将这些活性位点突变为丙氨酸（A），并比较了突变前后真实EC编号的预测得分。突变后，真实EC编号的预测得分有所下降，这表明活性位点的突变对EC编号预测有影响。在突变的酶中，59.1%被识别为非酶类，如L-2-羟基戊二酸脱氢酶（Uniprot ID: A0A011QK89）和法呢基焦磷酸合酶（Uniprot ID: B4YA15）。此外，作者比较了突变前后活性位点的预测得分，发现突变后活性位点的预测得分下降，这表明模型对突变后活性位点的关注度降低。

作者对GraphEC进行了模块消融研究，以评估各模块的贡献。当移除标签扩散时，AUC值略有下降（图3D），这可能是因为GraphEC能够学习同源信息的能力。当移除活性位点指导时，NEW-392和Price-149的AUC分别下降了2.8%和3.5%，这表明活性位点指导的重要性。为评估ESMFold预测结构的影响，构建了一个不考虑几何信息的基线模型（BiLSTM）。在没有结构信息的情况下，NEW-392和Price-149的AUC分别下降了4.8%和2.1%，表明预测结构至关重要。ProtTrans嵌入用于增强节点特征，移除后AUC分别下降了6.6%和2.8%。这里使用的ProtTrans嵌入是残基级别的表示，与CLEAN中使用的蛋白质级别ESM-1b表示（均值表示）不同。

如图3E所示，作者将学习到的几何嵌入（GraphEC嵌入）与ProtTrans嵌入和one-hot嵌入在NEW-392上进行了比较。在十个最常见的EC编号中，one-hot嵌入的区分能力有限。ProtTrans嵌入能够大致区分这些EC编号，但无法将3.1.2.22和4.2.1.113所属的类别聚类。而GraphEC嵌入则可以清晰地分离这些EC编号，展示了其对不同EC编号的强大表达能力。同样地，在Price-149数据集中，one-hot嵌入缺乏区分能力，ProtTrans嵌入提供了基本的区分，而GraphEC嵌入则能进一步区分这些编号。

为评估预测结构的重要性，作者将ESMFold预测的结构替换为AlphaFold2预测的结构。在NEW-392上，使用AlphaFold2预测的结构时，AUC、召回率、精准度和F1分别为0.9004、0.8267、0.5745和0.6044（补充表S6），略高于使用ESMFold预测结构时的表现。在Price-149上，使用AlphaFold2预测结构和ESMFold预测结构时，性能相当。结果表明，ESMFold可以在比AlphaFold2更短的时间内生成具有相近准确度的结构。

为验证GraphEC是否可以识别功能区域，作者研究了预测的酶活性位点、多头注意力分数与真实活性位点之间的关系。如图3F所示，酰基蛋白硫酯酶2的真实活性位点为S122、D176和H210，这些位点通过GraphEC-AS正确预测并用于指导EC编号预测。多头注意力分数在接近真实活性位点时趋于更高，表明模型能够关注到功能区域。类似地，脯氨酸消旋酶的酶活性位点也被准确识别，多头注意力分数在接近真实活性位点时尤为突出（图3G）。这些结果表明，GraphEC能够捕捉酶的功能区域。

由于酶的pH值对酶功能至关重要，作者还纳入了酶的最佳pH值预测。为训练模型，作者从Brenda数据库（2023年1月发布）中整理了一个新数据集，包含4110个序列相似性小于25%的蛋白质。数据集按照4:1的比例根据提交时间分为训练集（Brenda-train，3297个酶）和独立测试集（Brenda-test，813个酶）。

图 4

如图4A所示，GraphEC-pH在五折交叉验证中的AUPR（精确率-召回率曲线下的面积）为0.9321，在测试集上的AUPR为0.9170，显示了模型的稳健性。当移除结构信息时，GraphEC-pH的AUPR下降了1.4%。相比之下，最新的两种方法EpHod和EpHod_SVR表现较差，位于GraphEC-pH的精确率-召回率曲线下方。相应地，GraphEC-pH的F1、召回率和精准度分别为0.8487、0.8672和0.8461，分别比第二好的方法EpHod高出9.2%、16.5%和0.09%（图4B）。这些结果展示了模型的优越性能。

随后，作者评估了模型区分Brenda测试集中由DIAMOND搜索的289对同源酶对之间差异的能力。在这些同源酶对中，超过87.9%（254对）具有相同的最佳pH类型（即“酸性”-“酸性”和“非酸性”-“非酸性”），GraphEC-pH能够正确识别其中的95.7%（243对）。只有35对酶表现出不同的最佳pH类型（即“酸性”-“非酸性”），其中GraphEC-pH正确区分了14对，比EpHod多出75%（EpHod正确区分8对）。这些结果表明，GraphEC-pH在一定程度上能够辨别同源酶之间的差异。

为发现新的酶功能，作者从Swiss-Prot（2024年1月发布）收集了共计570,830个蛋白序列。经过去除序列相似性大于25%的蛋白质以及与训练数据集相似性超过25%的蛋白质后，剩下52,037个没有EC编号注释的蛋白质。这些蛋白质通过GraphEC和CLEAN进行了注释，其中超过21%的蛋白质包括相同的EC编号注释。对于每个蛋白质，获取了预测的EC编号，并计算了与训练集中相同EC编号蛋白质的TM-Score，随后使用这些蛋白质的最大TM-Score进行分析。GraphEC总体得分较高，超过82%的蛋白质通过Foldseek显示出比CLEAN更高的TM-Score。

图 5

在比较最大TM-Score超过不同阈值的酶数量时（图5A），GraphEC在0.5、0.7、0.8和0.9阈值下分别比CLEAN多出158%、136%、128%和128%。与CLEAN相比，GraphEC发现的最大TM-Score超过0.8的新酶功能部分列于补充数据集1。尽管序列相似性较低，GraphEC能够从结构相似度高的酶中学习功能信息（图5B）。即使TM-Score较低，酶活性位点周围的酶口袋仍能对齐（图5C），显示了GraphEC从酶结构中学习关键功能信息的能力。

Song, Y., Yuan, Q., Chen, S., Zeng, Y., Zhao, H., & Yang, Y. (2024). Accurately predicting enzyme functions through geometric graph learning on ESMFold-predicted structures. Nature Communications, 15(1), 8180.