Nat. Commun. | 揭示mRNA降解机制，宾夕法尼亚州立大学构建稳定性预测模型

今天为大家介绍的是来自宾夕法尼亚州立大学的Howard M. Salis团队的一篇论文。mRNA降解是影响基因表达水平的重要过程，但由于降解速率由多种相互关联的因素共同决定，仅通过序列预测mRNA的稳定性仍充满挑战。本研究对超过50,000条细菌mRNA进行了大规模的并行动力学降解测量，并采用“设计驱动学习”的方法开发和验证了一个预测mRNA稳定性的序列到功能模型。研究中设计的mRNA系统性地调整了其翻译速率、二级结构、序列组成，以及包含特定RNA结构的G-四链体和i-模体，同时调控RppH酶的活性，其半衰期从约20秒到20分钟不等。研究整合了生物物理模型与机器学习方法，构建了高精度、高通用性的mRNA稳定性稳态模型和动力学降解模型，并通过转录速率模型识别mRNA同工型，利用翻译速率模型计算核糖体对mRNA的保护效果。总体而言，该模型量化了细菌操纵子中共同影响mRNA稳定性的关键相互作用，并能够预测序列变化如何改变mRNA的稳定性。这对细菌遗传系统的研究与工程设计具有重要意义。

设计高性能遗传系统的关键在于建立更全面的预测平台，用于分析基因序列如何控制基因表达水平。然而，目前对于细菌mRNA降解速率的研究较为有限，而这正是影响蛋白质稳态水平和基因响应时间的关键因素。即使是很小的mRNA序列变化，也可能导致降解速率的10倍变化。因此，开发一个能够准确预测mRNA降解速率的模型，对代谢通路、基因电路、生物传感器和基因组的工程设计有重要意义。

mRNA的降解过程涉及多个相互关联的因素，如核糖体保护作用、mRNA结构（G-四链体等）、RNase结合位点以及RNA修饰酶的参与。作者通过设计62,120种合成mRNA序列，全面探讨这些因素的组合对降解速率的影响。作者在细菌中使用rifampicin处理后测量mRNA的降解速率，并结合生物物理建模和机器学习，构建了一个序列到功能的预测模型。这个模型不仅能准确预测mRNA的稳态水平和半衰期，还能识别5′ UTR中对降解影响最大的序列特性。

该模型基于过去对mRNA降解酶的研究，包括RNase E、RNase G和RppH等的作用机制。例如，RppH的去磷酸化活性对转录起始位点的前几个核苷酸非常敏感。此外，研究表明，未结构化的5′ UTR会加速mRNA降解，因为它为RNase E/G提供了更多结合位点。相比以往使用天然或小规模合成mRNA的研究，本研究通过大规模系统设计，解决了现有数据不足的问题，为遗传系统的精准工程提供了重要工具和方法。

研究人员大规模设计并构建了62,120个5′ UTR（信使RNA的5′非翻译区）序列，以研究其如何影响mRNA的降解速率。设计重点包括多个关键因素：（1） RppH结合位点，这是 mRNA 转录本的前四个核苷酸；（2）单链区域的长度和序列组成；（3）mRNA次级结构（如发夹、内部环等）的数量和折叠能量；（4）特殊的高级结构，如G-四链体和i-结构；（5）核糖体结合位点的翻译效率。

作者将这些序列分为多个实验组，每组分别测试不同因素的组合。例如，一组测试了1,280种5′ UTR，通过改变RppH结合位点和核糖体结合位点来覆盖10,000倍的翻译速率变化。其他实验组则重点探索单链RNA序列（如polyA, polyU）和特定结构（如发夹和G-四链体）对RNase结合位点的可及性和保护作用。

图 1

所有设计的5′ UTR通过170核苷酸的合成寡核苷酸编码，并附带独特条形码。作者通过两步克隆技术将它们整合到表达系统中，与报告基因sfGFP连接。虽然sfGFP本身并未用于测量蛋白质水平，但其核糖体结合速率为研究提供了一个可控环境。在E. coli中构建的质粒库通过MiSeq测序验证，结果显示覆盖率高达96.1%。图1A展示了核糖体结合如何影响mRNA的降解过程。

为了研究设计的mRNA如何影响降解速率，科学家们进行了大规模平行实验，量化了62,120种mRNA的稳态和动力学降解速率。作者将混合细胞库在选择性LB培养基中培养，使细胞保持在指数生长期。作者随后加入rifampicin——一种抑制细菌转录的化合物——它停止新的mRNA合成，但保留了RNA降解机制。作者在多个时间点（T0, T2, T4, T8, T16）取样，通过RNA保护剂RNAprotect处理后提取总RNA。

为了确保不同时间点的数据可比性，作者在每份样本中加入已知浓度的对照RNA（spike-in RNA），并进行rRNA去除、cDNA合成和条形码扩增，最终通过Illumina NovaSeq测序获得超过16亿条读数。实验结果显示，91.5%的DNA条形码和93.5%的mRNA条形码在T0时的读数超过100，表明实验覆盖率非常高。随着时间推移，mRNA条形码的读数逐渐减少，符合指数衰减趋势。

作者使用公式M(t) = M0 e–kt（M0为初始mRNA水平，k为降解速率常数）对每种mRNA的降解进行拟合，并计算出半衰期（t1/2 = log(2)/k）。如图1C所示，不同mRNA的降解曲线差异显著，覆盖从0.31分钟到25.4分钟的半衰期范围，具体展现了生理相关时间尺度的多样性。图1D进一步展示了设计的5′ UTR序列如何显著改变mRNA的体内降解速率，为优化基因表达提供了宝贵的实验数据和模型验证。

为了探究控制mRNA降解速率的多种因素，作者对设计的mRNA序列进行了深入分析。初步结果显示，单一因素（如RppH结合位点、翻译速率、5′ UTR的ssRNA数量）的影响较为有限，且同类别内部的差异可能超过类别之间的差异。因此，作者采用了多因素分析的方法，系统评估这些因素在不同条件下的综合作用。

图 2

在多因素分析中，研究发现当RppH结合位点稳定且5′ UTR的ssRNA长度适中（11-40个核苷酸）时，翻译起始速率对mRNA降解速率的影响最为明显。数据显示，翻译速率较高的mRNA通常更稳定（图2A）。此外，ssRNA数量的增加显著提高了mRNA的降解速率，但这一趋势仅在翻译速率较高且RppH结合位点稳定的情况下清晰可见（图2B, C）。当翻译速率较低时，mRNA的降解速率本就较高，增加ssRNA对其影响较小。

序列组成对mRNA稳定性也起到了关键作用。例如，polyA序列的影响显著高于polyU或polyC，尤其在高翻译速率条件下，polyA导致更高的降解速率变化范围和分布（图2D, E）。此外，5′ UTR中的G-四链体结构展现了保护mRNA的作用，使其降解速率保持较低且稳定（约0.2 1/min, 图2F），而引入i-结构则显著加速了mRNA的降解（约0.5 1/min, 图2G）。

图 3

作者开发了一种结合生物物理计算和机器学习的mRNA降解率预测模型，旨在揭示影响 mRNA 稳定性的关键设计因素（图3）。首先，作者列出了影响mRNA水平和降解率的潜在因素，包括启动子转录起始速率、RppH 结合位点、mRNA的结构类型和位置、5′ UTR 中单链RNA（ssRNA）的数量，以及CDS的翻译起始速率等。利用多个热力学模型（如Promoter Calculator v1.0和RBS Calculator v2.1），计算了这些特征的具体数值。此外，作者还采用RNA二级结构计算工具（如Vienna RNA v2.4.11）分析了mRNA结构特性。

通过实验发现，mRNA转录起始区（初始转录区, ITR）前四个核苷酸显著影响其降解速率，基于此，作者利用Promoter Calculator预测了最常见的mRNA异构体，并分别计算了它们的结构和功能特性。随后，作者采用LightGBM算法训练并测试模型，结果表明，该模型在预测mRNA稳态水平方面表现最佳，而在预测 mRNA 降解速率方面表现较为一般。关键特征如RppH结合位点、启动子转录速率和CDS翻译速率被证明对模型性能至关重要，而mRNA内部环长度等特征的重要性较低，模型也未因此获得显著改进。

图 4

作者通过已开发的LightGBM模型，对mRNA的降解速率设计规则进行了深入分析，明确了多种独立因素对 mRNA 稳定性的作用机制（图4）。作者选取了一个具有高稳定性的基准mRNA，通过系统性调整其特定特征值，分析了这些变化对mRNA稳定性的影响。

研究结果显示：

RppH结合位点：结合位点的碱基组成对mRNA稳定性有显著影响，尤其是由相同核苷酸组成的结合位点（即同质性结合位点）会显著降低稳定性（图4A）。

翻译起始速率：翻译起始速率与mRNA的稳态表达水平呈S型关系。提高速率会增加蛋白质表达量，但在特定点后达到平台，不再有显著提升（图4B左）。

5′ UTR单链RNA：5′ UTR中较长的单链RNA会降低mRNA稳定性，这种影响在富含C或A的序列中尤为明显。相比之下，聚腺苷酸链因其刚性更容易被RNase降解（图4B中）。

mRNA二级结构：增加mRNA的二级结构对其稳定性影响较小，真正关键的因素是未折叠RNA的存在或缺失，而非二级结构的数量（图4B右）。

本文研究设计了62,120种5′ UTR序列，利用条形码细胞文库和深度测序定量测量mRNA稳态水平和降解速率，发现UTR序列特性显著影响mRNA半衰期（20秒至20分钟）。通过整合生物物理模型和机器学习（LightGBM算法），构建了预测mRNA稳定性的模型，解析了关键序列-功能关系。研究揭示了四类主要影响mRNA降解的机制，包括5′端序列调控RppH结合、翻译启动速率对mRNA稳定性的非线性影响、非结构化单链RNA对RNase易感性，以及G-四链体结构增强mRNA稳定性。这些机制在细菌间具有保守性，为基因表达调控提供了新见解，并开发了可用于设计遗传系统的mRNA稳定性计算器和在线平台。

编译|于洲

审稿|王梓旭

Cetnar D P, Hossain A, Vezeau G E, et al. Predicting synthetic mRNA stability using massively parallel kinetic measurements, biophysical modeling, and machine learning[J]. Nature Communications, 2024, 15(1): 9601.