Science Advance首次揭秘古菌外层结构：Cryo-ET解析甲烷螺旋菌外膜与表面层原位蛋白

在我们的日常生活中，我们通常能够看到各种各样的微生物，它们在自然界中扮演着至关重要的角色。虽然细菌和真核生物的细胞结构在形态上有很多相似之处，但有一类微生物——古菌，其细胞结构却有着独特的特点。

与细菌和真核生物相比，古菌在细胞外膜、分子组成以及演化起源上都存在显著差异。更为独特的是，古菌的某些表面层蛋白质（SLPs）能够以特定的方式排列成六角形网格状结构的连续层（S层），从而有效保护细胞免受外界环境因素的影响。它们主要由蛋白质和糖蛋白亚基组成，在很多古菌中起到了替代细胞壁的作用。尽管过去几十年中，科学家们通过电子显微镜等技术对这些表面层进行了观察，但它们的具体分子结构和细胞分裂过程中发挥的作用仍然不甚明了。

为了解决这一难题，加州大学洛杉矶分校（UCLA）周正洪教授团队利用冷冻电子断层扫描（cryo-ET）技术，成功解析了古菌模型物种——甲烷螺旋菌(Methanospirillum hungatei) 的表面层蛋白（SLP）结构，并揭示了其六聚体拼接的详细信息。文章于2024年12月13日发表在《Science Advances》上。

在了解甲烷螺旋菌之前，我们首先需要了解古细菌（Archaea）与细菌（Bacteria）和真核生物（Eukarya）之间的差异。古细菌和细菌在形态上有很多相似之处，但它们的细胞壁、细胞膜及其组成有显著的不同。与真核生物不同，古细菌没有膜包围的细胞核，也没有含脂肪酸的细胞膜。此外，古细菌的表面层（S层）与植物、真菌和藻类的细胞壁差异较大。不同于大多数细菌细胞壁中含有肽聚糖（peptidoglycan），古细菌的S层通常不含肽聚糖，并且它们的磷脂膜使用的是与脂肪酸不同的醚键（ether-linked）植物酰基（phytanoyls），这种脂质成分的链长可能为C20或C40。

甲烷螺旋菌是一种生活在废水中的古菌，它通过与细菌和真菌共同工作，将复杂的有机物质转化为甲烷、水和二氧化碳。其细胞形态呈弯曲或螺旋状，直径约为0.4至0.5微米，长度可达到7微米，具有极性鞭毛，能够在环境中移动并响应化学物质刺激。

甲烷螺旋菌的细胞膜外没有细胞壁，而是被一个蛋白质构成的表面层包围，这个表面层与含有肽聚糖的细菌细胞壁功能类似。

此外，细胞的外部膜层（outer sheath）包围着多个甲烷螺旋菌细胞，将它们连接形成链条，从2个细胞到超过70个细胞的长链，最大可以达到500微米长。这种群体化结构为甲烷螺旋菌在极端环境中提供了保护，并有助于它们在废水处理中发挥作用。

为了深入研究甲烷螺旋菌的细胞外膜层结构，研究人员采用了冷冻电子断层扫描（Cryo-ET）技术。通过这一技术，研究人员能够以极高的分辨率观察到甲烷螺旋菌表面层的详细结构（图1A至D）。重建的断层扫描图像显示，甲烷螺旋菌的细胞外膜由一层蛋白质表面层（S层，S-layer juncture）构成，夹在细胞膜和外部的鞘层之间。这一结构形成了两个周质空间（periplasmic spaces，PS-1和PS-2），其中PS-1位于细胞膜和S层之间，PS-2则位于S层和外鞘层之间（图1A至C）。

通过电子断层扫描，研究人员还发现，S层的蛋白质单元排列成六角形的网格状结构，每个单元之间的距离约为15纳米，而S层的厚度约为9.5纳米，整个S层除了顶部位置外在细胞的长度上保持均匀（图1E）。这种六角形的结构不仅保护了细胞膜，还帮助细胞适应了环境中的各种变化。

为了进一步了解甲烷螺旋菌表面层的组成，研究人员使用体内细胞表面生物素标记法来鉴定甲烷螺旋菌的S层蛋白质（SLPs）。经过细胞标记、蛋白提取和亲和纯化后，通过SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）观察到一个约116 kDa的主要蛋白质，这可能是经过翻译后修饰的糖蛋白（图1F）。通过液相色谱–串联质谱（LC-MS/MS）分析，研究人员确定了两种几乎完全相同的蛋白质（Mhun_2263和Mhun_2513），它们在完整细胞中高度丰富。这两种SLP同源蛋白有约88.5%的氨基酸序列相似性，都具有约216个氨基酸的“未知功能域（DUF3821）”，这一域在许多甲烷生成古菌中普遍存在。DUF3821区域的功能仍不完全明确，但它可能在S层的形成和稳定中起重要作用。

此外，Mhun_2263蛋白质还包含一个PGF-CTERM结构域，这一结构域可能参与后翻译修饰并帮助蛋白质锚定到细胞膜上。这种后翻译修饰过程对于S层的正确组装和功能至关重要。

接下来，研究人员利用冷冻电子断层扫描技术（Cryo-ET），以及子断层图像平均法STA（sub-tomogram-average）详细解析了S层六聚体的原位结构（图2A至C）。（对于此技术的介绍请见文末往期文章链接）甲烷螺旋菌的S层蛋白质单元通过相互作用形成六聚体，每个六聚体由六个蛋白质单元组成，呈穹顶状（图2B）。冷冻电子断层扫描技术揭示了这一结构的高分辨率细节。通过与AlphaFold预测的免疫球蛋白样（Ig-like）结构域的结合，研究人员成功构建了甲烷螺旋菌SLP单体的伪原子模型（图2B和C），六聚体的形态与免疫球蛋白样（Ig-like）结构域相似，每个蛋白质单元包含多个Ig-like结构域，并且一个靠近三聚体（trimeric），这些结构域通过相对灵活的连接体连接，形成完整的六聚体。该结构通过丰富的相互作用连接在一起，形成一个稳定的六角形网格。

此外，与其他古菌物种的S层六聚体相比，甲烷螺旋菌的六聚体更加紧凑，单元的排列更为复杂（图3）。这种高度精细的结构有助于S层在细胞膜上的稳定性，并可能支持细胞的运动性和与环境的物质交换。

甲烷螺旋菌的细胞呈螺旋状，因此细胞外部S层六聚体的排列方式需要适应这种特殊的形状。研究发现，S层六聚体的排列呈现三种不同的方向：一种沿着细胞的螺旋轴线排列，另外两种则环绕细胞的侧面排列（图4）。这种特殊的排列方式使得S层能够完美适应甲烷螺旋菌的螺旋形状，从而保持表面层在细胞外膜上的稳定性。S层的这种适应性是细胞结构与功能的关键，确保细胞能够维持其独特的形态。

在S层六聚体的结构中，研究人员还发现了多个小孔，这些小孔的大小足以让小分子物质进出细胞，支持物质交换。这一发现表明，S层不仅在保护细胞膜、维持细胞形态方面起着重要作用，同时也为细胞提供了与环境交换物质的通道。例如，这些小孔可能允许细胞与外部环境中的甲烷、二氧化碳或其他小分子物质进行交换，支持其生长和繁殖。

该研究不仅为古菌细胞膜的三维结构提供了新视角，还为理解表面层蛋白的组装和细胞保护机制提供了关键线索。与大多数古细菌的球形或变形S层不同，甲烷单胞菌的S层采用适应其细胞外鞘层圆柱形状的结构，以包裹细胞膜。这一独特结构通过不同的分子交互作用形成六聚体结构，并展现出明显的非对称曲率（curvature）。研究还发现，后转译修饰的S层蛋白（SLP）形成了类似穹顶的六聚体单元，这些特殊的蛋白质结构帮助细胞完成S层的组装。

甲烷单胞菌的S层不仅在分子上表现出独特的渗透性，还通过其“蛋箱”形态（类似华夫饼）提高了表面积，增强了与外界的物质交换能力。这一结构允许小分子（如氢气、二氧化碳和乙酸）通过，从而满足细胞的代谢需求。此外，甲烷单胞菌的S层还在细胞两端形成特殊的“端塞”结构，确保细胞的完整性与功能，同时鞭毛和纤毛帮助细胞运动。研究表明，这些端塞结构显著影响了细胞的方向性和运动能力，并且S层的组装过程与细胞生长和分裂紧密协调，确保细胞结构的稳定性。

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