破解结核分枝杆菌分泌结构，助力攻克结核病肆虐

长期以来，结核病一直是严重的公共卫生问题。18世纪中期，欧洲30％的死亡人群都与结核病相关。随着抗结核药物的发明，情况似乎有所好转。然而，由于公共卫生资源不足、免疫反应减弱、耐药性形成等原因，这个具有千年历史的疾病仍然在全世界范围内继续肆虐，结核病仍然是单一传染性病原体造成死亡的最主要原因。

与革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌不同，结核分枝杆菌会形成一层厚而复杂的包被。分枝杆菌的细胞壁从内到外由三个共价连接层组成——肽聚糖层，阿拉伯半乳聚糖网，和由糖脂层非共价包围的霉菌酸层。这些不寻常的共价连接层构成了一个渗透屏障。通常分枝杆菌细胞膜的通道可以通过分泌毒力因子和促进抗生素外排来主导分枝杆菌的病程，在分枝杆菌细胞壁或荚膜上发挥作用的具体分泌通道可能是更好的治疗或干预靶点，但尚未得到研究。

中国科学技术大学生命科学学院的Weimin Gong教授、加州大学洛杉矶分校微生物学、免疫学和分子遗传学系的Z. Hong Zhou教授及其团队通过冷冻电镜技术探究了潜在的抗结核药物靶点：一种位于结核分枝杆菌H37Rv细胞膜上的蛋白Rv3705c和同源MSMEG_6251的环状结构。2021年8月20日，文章以Identification and architecture of a putative secretion tube across mycobacterial outer envelope为题发表在Science Advance上。

首先，研究采用了传统的蛋白质晶体学方法。他们纯化获得了mtTiME-SD和msTiME-SD的晶体，并在不同分辨率下探究了其结构。该结构受到两个分子内二硫键的约束，可能与稳定TiME蛋白的单体结构有关。mtTiME-SD和msTiME-SD晶体的四元结构也具有很高的相似性，一个单体中的G31/33R、G48/50R和A89/91R可能促进mtTiME-SD和msTiME-SD在溶液中形成低聚物。

为了确定全长蛋白的结构，该研究从细胞膜中纯化了mtTiME-FL并重组，使用冷冻电子显微镜进行数据采集和三维重构。冷冻电镜分析发现mtTiME可以在溶液中形成D8或D7复合物，且D8应该是主要的复合物形式，进一步分析显示D8对称mtTiMEFL配合物中的八聚环堆叠在一起，其中两个环中的两个相对单体以36°旋转相连，其N端以尾对尾的方式聚集在一起。

为了探索TiME-FL环是否能在脂质双层膜上形成孔，该研究采用了脂质体结合和单通道记录实验。使用对称电解质缓冲液和+60 mV或- 60 mV的电压电位，在mtTiME-FL或mtTiME-FL重组的平面脂质双分子层上记录的单通道电流比单独在平面脂质双分子层上记录的电流高4到5倍，证明了这两种蛋白的成孔作用。5(6)-羧基荧光素(CF)泄漏实验也验证了TiME-FL环的成孔活性。而且TiME-SD不能插入脂质双分子层形成孔，说明TiME-FL的N端螺旋α0是形成跨膜孔的必要条件。总之，这些实验证明TiME-FL在脂质双层膜上形成一个跨膜孔，允许10 Å大小的分子通过。

在双相聚合物中重建的msTiME-FL形成了由偶数环堆叠的管状结构，mtTiME-FL也形成管状结构。mtTiME中的D145-G146或msTiME中的N147-F148是位于TiME单层环头部投影回路中的残基，可能参与双层配合物的堆叠形成管。管状结构的形成在TiME蛋白中是保守的，并且是通过以头对头的方式堆叠双层复合物形成的。

为了研究TiME蛋白是否也位于分枝杆菌的荚膜上，研究者分离了耻垢分枝杆菌mc2155的荚膜、细胞壁和质膜部分，并通过Western blot检测了这些部分中msTiME的存在。同时，用从mc2 155突变体中分离的这些部分作为对照进行了相同的实验。数据证实了msTiME在质膜中的丰度低于细胞壁中的丰度。野生型耻垢分枝杆菌的荚膜部分也检测到msTiME，而在msTiME突变体的荚膜部分未检测到msTiME。因此，msTiME分布在耻垢分枝杆菌的细胞膜上，在被囊和细胞壁上丰度较高，在质膜上丰度较低。

管状msTiME分布在耻垢分枝杆菌细胞壁和被膜上，提示其可能具有蛋白质分泌功能。为了检测msTiME是否参与蛋白质分泌，研究者采用SDS-PAGE和无标记定量质谱法比较了野生型和msTiME耻垢分枝杆菌mc2 155培养滤液中的蛋白质组成，并通过mRNA水平进行校准。结果表明msTiME通过其环状和管状结构参与耻垢分枝杆菌蛋白的分泌。

该研究通过冷冻电镜揭示了分枝杆菌msTiME结构，并通过功能分析验证了TiME是促进分枝杆菌中蛋白质分泌的重要因素，为基于此结构的抑制剂设计打开了新的大门。

冷冻电镜成像技术（Cryo-EM，Cryo-ET）能够在分子生物学研究、细胞学研究乃至医学临床研究中发挥决定性的作用。鑫研微末团队在生物大分子及其复合体的三维结构解析方面技术成熟、经验丰富，能够在原子级分辨率解析多种生物大分子材料的三维结构。我们致力于为药企和高校医院科研工作者提供一站式、自动化、原子级分辨率的结构解析服务，助力创新药物研发和科研成果转化，帮助科研人员实现“原子结构自由”。