《Science》解锁端粒酶研究新密码：从结构探秘到功能解析

在细胞的微观世界里，有一个至关重要的 “守护者”—— 端粒酶，它默默地守护着染色体的端粒，维持着细胞的正常生命活动。端粒酶是一种核糖核蛋白（RNP）复合物，它能够延长线性染色体 3' 末端的端粒 DNA，从而抵消因 DNA 复制和核酸降解过程导致的 DNA 损耗。端粒就像是染色体末端的 “帽子”，在细胞每次分裂时，这顶 “帽子” 都会被磨损一点，当 “帽子” 被磨损殆尽，细胞就会走向衰老甚至死亡。而端粒酶则能够像一个勤劳的 “修补匠”，不断为端粒补充 “材料”，让端粒保持完整。虽然端粒酶在体细胞中大多处于无活性状态，但在干细胞中具有活性，并且在大多数癌细胞系中表现出高活性，对于癌细胞的无限增殖表型而言，端粒酶的活性至关重要。它是衰老、肿瘤发生和干细胞更新过程中的重要调节因子。因此深入研究端粒酶的结构和功能，对于我们理解衰老、攻克肿瘤以及推动干细胞治疗等领域的发展具有重要意义。

美国加州大学分子与细胞生物系Juli Feigon和Z. Hong Zhou教授团队通过冷冻电镜揭开了端粒酶的神秘面纱。本研究以约 9 埃分辨率报告了嗜热四膜虫端粒酶的冷冻电镜结构。除了已知的七种全酶蛋白外，还鉴定出另外两种蛋白，它们与单链端粒 DNA 结合蛋白 Teb1 形成一个复合物（TEB），该复合物与异源三聚体复制蛋白 A（RPA）是旁系同源物。p75 - p45 - p19 亚复合物被鉴定为另一种与 RPA 相关的复合物，即 CST（CTC1 - STN1 - TEN1）。这项研究揭示了 TER 在 TERT - TER - p65 催化核心中的路径以及单链 DNA 的出口；TERT 关键的 N 端结构域、p50 和 TEB 之间广泛的亚基相互作用；以及其他亚基的身份和结构，包括 p19 和 p45C 的晶体结构。总的来说，本研究通过解析嗜热四膜虫端粒酶的冷冻电镜结构，发现新亚基并揭示其功能及相互作用，为理解端粒酶全酶功能提供了结构和机制方面的见解。

端粒酶就像细胞的“延长工具”，专门负责修复染色体末端的保护帽（端粒）。每次细胞分裂时端粒会缩短，端粒酶通过添加特定重复序列（如人类的TTAGGG）来延缓缩短，维持细胞活力。端粒酶主要由RNA模板（TER）和逆转录酶（TERT）组成。端粒酶的工作流程在不同生物之间存在差异。在人类中，由保护蛋白复合体（shelterin）中的TPP1-POT1像“导航”一样将端粒酶引导到端粒。端粒酶利用RNA模板合成富含G的DNA链（如TTGGGG）。另一组蛋白（CST复合物）招募DNA聚合酶α，合成互补的C链，形成完整双链。酵母则使用Est1等特有蛋白辅助招募端粒酶。在嗜热四膜虫（单细胞生物）中， 端粒酶结构稳定，易于研究，目前研究已发现其包含Teb1（类似DNA结合蛋白RPA）和新型复合物CST（帮助C链合成）。

在本研究中，研究者们通过冷冻电镜等技术，看清了嗜热四膜虫端粒酶的精细结构：

通过高精度的冷冻电镜技术，成功“拍”到了嗜热四膜虫（一种单细胞生物）端粒酶全酶的清晰照片，分辨率高达9.4 Å（1 Å = 0.1纳米），甚至部分区域达到了8.9 Å。这让我们能够看清端粒酶的精细结构，就像拼图一样，逐步还原它的全貌。研究者在嗜热四膜虫的端粒酶逆转录酶（TERT）上加了一个特殊标签（FZZ），方便从细胞中“钓”出完整的端粒酶全酶。然后使用冷冻电镜技术拍摄了数万张端粒酶的照片，并通过计算机将这些照片拼合成三维结构。

结果发现：端粒酶由多个部分组成，包括核心（TERT-TER-p65）、辅助蛋白（Teb1-Teb2-Teb3）和动态复合物（p75-p45-p19）。通过高分辨率图像，研究者还发现了一些新细节：首先，Teb1C蛋白的位置与之前猜测的不同，它位于TEN结构域后方，而假结（PK）则移到了另一侧。除此之外，p75-p45-p19复合物被发现是一个类似RPA（DNA结合蛋白）的三聚体，属于CST复合物家族，负责端粒的保护和复制。将这些部分像拼图一样组合起来，发现它们通过一个中心枢纽蛋白p50连接在一起，形成一个复杂的相互作用网络。

研究者通过冷冻电镜和晶体结构数据，揭示了嗜热四膜虫端粒酶逆转录酶（TERT）的精细结构。TERT由三个主要部分组成：RNA结合域（TRBD）、逆转录酶域（RT）和C端延伸域（CTE），它们形成一个环形结构，像一个“环形剧场”。TEN结构域位于环形的一侧，堆叠在CTE上，负责处理DNA和维持端粒酶的活性。端粒酶RNA（TER）则像一个“剧本”，包含模板、假结（PK）和激活结构域（SL4），环绕在TERT环上。模板从RT域底部穿过，负责合成端粒重复序列，而PK位于环的另一侧，像一个“棘轮扣”，帮助TER正确折叠并锁定在TERT环上。p65蛋白则像“导演”，通过与TER的SL4结合，促进端粒酶的活性和稳定性。研究者还发现，TER的模板边界元件（TBE）和S2结构像“锚点”，防止模板以外的部分被拉入活性位点，确保端粒酶精确合成端粒序列。这些发现揭示了端粒酶如何通过复杂的环形结构和RNA-蛋白质相互作用，完成染色体末端的修复任务，为理解细胞衰老和癌症提供了重要线索。

研究者在研究嗜热四膜虫端粒酶时，发现了一个有趣的现象：尽管已知Teb1蛋白是端粒酶的重要组成部分，但在冷冻电镜图像中，Teb1的某些区域（如Teb1C）清晰可见，而旁边却有一个“神秘凸起”，无法用已知蛋白解释。

通过进一步分析，研究人员推测这个凸起可能来自两个未被发现的蛋白，它们与Teb1形成类似RPA（复制蛋白A）的三聚体结构。为了验证这一猜想，研究者使用质谱技术分析了端粒酶的组成，果然发现了两个新蛋白（Teb2和Teb3）。这两个蛋白与Teb1一起组成了一个全新的复合物，命名为TEB。TEB与RPA类似，但专门结合端粒的单链DNA（G链），帮助端粒酶完成修复任务。有趣的是，Teb2和Teb3的表达水平与RPA的大亚基Rfa1相似，远高于其他端粒酶蛋白，这表明它们可能在细胞中扮演多重角色，既参与端粒修复，也可能参与其他DNA相关过程。

TEN结构域位于端粒酶核心（TERT环）的一侧，紧邻逆转录酶活性位点，像“控制台”一样协调端粒酶的组装和运作。它与多个关键蛋白（p50、Teb1C、Teb2N）直接接触，形成一个三角形网络，确保各部件紧密协作（图4A-C）。TEN结构域上的两个氨基酸（K90和R137）被证实为“关键按钮”。当它们被替换（如K90A突变），端粒酶的活性显著下降，说明这些位点对p50的激活作用至关重要（图4F）。实验中还发现，TEN特有的“β发夹结构”像一把钥匙，插入p50和Teb蛋白之间，若替换这个结构（如用GSSG替代），端粒酶将完全失去活性支持（图4B）。

p50蛋白的N端结构域（p50N）与人类TPP1蛋白的OB折叠结构类似，两者都能通过与TEN结构域结合，大幅提升端粒酶的持续合成能力（RAP）。冷冻电镜图像显示，p50像“桥梁”一样连接TEN和Teb1-Teb2-Teb3复合物，形成稳定的相互作用网络（图4A）。当p50缺失或被破坏时，端粒酶无法高效合成端粒重复序列，证明它在功能上类似于人类TPP1，是招募和激活端粒酶的关键角色。

TEB复合物是端粒酶的“稳定器”。Teb1与Teb2、Teb3组成“TEB复合物”，专门结合端粒单链DNA（G链）。实验发现，Teb1的C端α螺旋（ΔCTαH）若被删除，端粒酶在体内根本无法组装，说明Teb2和Teb3像“支架”一样稳定Teb1的结构（图4D-E）。当Teb1与Teb2-Teb3共同存在时，端粒酶的活性显著提升；单独使用Teb1则效果有限，表明TEB复合物通过协同作用增强端粒酶的稳定性和效率（图4E）。

这些发现首次在近原子水平上展示了TEN结构域如何通过多蛋白网络协调端粒酶的组装和功能，修正了此前对假结（PK）直接参与催化的错误假设。

科学家通过X射线晶体学和冷冻电镜技术，揭示了嗜热四膜虫端粒酶中一个全新的蛋白复合物——p75-p45-p19，并发现它与已知的CST复合物（在酵母、植物和哺乳动物中发现）在结构和功能上高度相似。

拆分来看：p19的晶体结构与人类Ten1蛋白的OB折叠结构相似，表明它可能是Ten1的同源物。p45由两个独立折叠的结构域组成，N端结合p19，C端包含两个翼状螺旋（WH）结构域，类似于Stn1蛋白。p75通过其N端与p50结合，可能包含多个OB折叠结构域，是复合物的核心支架。

p75-p45-p19复合物通过p75与p50的相互作用，连接到端粒酶核心，但其功能与TEB复合物（Teb1-Teb2-Teb3）不同。实验表明，p75-p45-p19对端粒酶活性的刺激作用较弱，且不会显著增加端粒重复序列的持续性合成（RAP），这与TEB复合物的强效作用形成对比。

CST复合物在酵母、植物和哺乳动物中已被广泛研究，主要参与端粒的保护和C链合成。此次在嗜热四膜虫中发现p75-p45-p19，首次证明CST复合物在纤毛虫中也存在。尽管不同生物的CST蛋白序列差异较大，但它们的结构域组成（如OB折叠和翼状螺旋）高度保守，表明它们在功能上具有相似性。

接下来，研究者设计了一段短端粒DNA，并在其5'端添加了生物素标记（一种“分子挂钩”），同时使用锁核酸（LNA）增强稳定性。这段DNA的前6个核苷酸与端粒酶的RNA模板结合，后13个核苷酸则延伸出来，模拟端粒DNA的合成过程。利用链霉亲和素（一种能结合生物素的蛋白质）将两个端粒酶全酶连接在一起，形成二聚体。这种方法帮助研究者在电镜下清晰观察到DNA的位置。

通过负染色电镜图像，科学家发现DNA从端粒酶的“背面”离开模板，朝向Teb1C（一种与DNA结合的蛋白）方向延伸（图6B-D）。这一路径表明，Teb1C可能负责捕获新合成的DNA，确保其正确释放并整合到染色体末端。实验还发现，无论DNA是否结合，端粒酶的核心结构（TERT）并未发生大规模变化。这说明端粒酶在合成DNA时保持稳定，不会因DNA的加入而“变形”。该实验成功追踪了端粒DNA在端粒酶上的“行走路径”，揭示了DNA如何从模板上释放并整合到染色体末端。

通过高分辨率结构解析，研究者揭示了端粒酶如何像一个“分子工厂”一样，通过TER、TERT、TEB和CST复合物的精密协作，完成染色体末端的修复任务。

首先，端粒酶有“三大模块”，分别是：

其次，TER像一条“丝带”环绕在TERT环上，与TERT的四个结构域（TRBD、RT、CTE、TEN）紧密接触，确保模板RNA正确引导DNA合成。TEN结构域位于TERT环的一侧，与TER、Teb1、Teb2和p50相互作用，像一个“控制台”协调端粒酶的组装和功能。新合成的DNA从模板RNA的3'端延伸出来，朝向Teb1C方向移动。科学家通过链霉亲和素标记实验，确认DNA从端粒酶的“背面”离开，最终被Teb1捕获（图6B-D）。TEN结构域不仅帮助处理单链DNA，还可能参与DNA与模板RNA的分离，确保DNA正确释放并整合到染色体末端。嗜热四膜虫的TER与TERT相互作用模式在其他生物中也高度保守，例如人类TER的假结（PK）和茎环结构（P6.1）可能与TERT以类似方式结合。尽管不同生物的CST复合物序列差异较大，但它们的结构域组成（如OB折叠和翼状螺旋）高度相似，表明它们在功能上具有一致性。

本文通过冷冻电镜、晶体学等技术，深入研究嗜热四膜虫端粒酶。发现其是由 TERT - TER - p65 催化核心、TEB（Teb1 - Teb2 - Teb3 ）、CST（p75 - p45 - p19）三个通过 p50 相连的三元复合物构成的复杂核糖核蛋白。催化核心中，TER 与 TERT 主要通过 t/PK 结构域和 L4 相互作用，TEN 结构域对催化循环至关重要。研究端粒酶与端粒 DNA 复合物发现，端粒 DNA 从端粒酶背面离开模板并朝向 Teb1C，还构建了端粒 DNA 路径模型。此外，嗜热四膜虫端粒酶中两种 RPA 相关复合物的发现，为理解人类 TPP1 - POT1 和 CST 的相互作用及功能提供参考。总之，该研究为端粒酶作用机制提供新见解，揭示了不同生物端粒酶在作用和调控上的共性。

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