HCMV疫苗研发新思路：结构生物学介导的突变构建减毒活疫苗

人体内有一种病毒，能悄无声息地潜伏在我们的细胞中，终身潜伏感染，等待时机爆发周期性再激活，全球血清患病率接近83%。这种病毒就是人巨细胞病毒Human cytomegalovirus（HCMV），它属于β疱疹病毒家族，广泛存在于人群中，对健康人群通常没有危害，但对免疫缺陷人群和新生儿来说，却构成了严重的威胁——HCMV是世界范围内导致出生缺陷的主要病毒，每200名新生儿中就有1人感染HCMV，并经常导致失明、小头畸形和耳聋等神经系统残疾，因此，防治HCMV重要且紧迫。抗HCMV的药物的肾毒性和耐药毒株的出现，使减毒活病毒的疫苗开发成为炙手可热的话题。

先前的HCMV减毒活疫苗候选疫苗来自实验室菌株，与WT相比缺乏多个基因，目前在预防感染方面的效果有限。2024年5月，来自加州大学洛杉矶分校（UCLA）的周正洪教授作为通讯作者发表文章Structure-guided mutagenesis targeting interactions between pp150 tegument protein and small capsid protein identify five lethal and two live-attenuated HCMV mutants，研究利用结构对pp150- SCP相互作用所必需的几个保守结构域进行突变分析（结构导向的诱变技术），确定了一个显著减弱病毒复制的突变（pp150-K255E），并证实pp150与感染细胞细胞核内的病毒衣壳相关。本研究可能为开发减毒活疫苗提供新的思路，也为理解HCMV病毒的复制机制和开发更多针对HCMV的治疗方法提供了重要的线索。

和α和γ疱疹病毒相似，身为β疱疹病毒家族的HCMV病毒粒子也有四层：大的双链DNA基因组被紧紧包裹在二十面体衣壳中，衣壳被无定形被膜蛋白包裹，并被脂质包膜包裹。病毒衣壳包括955个MCP（major capsid protein）拷贝。Tri（triplex protein complexes）为三联体蛋白复合物，1个Tri包括1个Triplex 1和2个Triplex 2（Tri2A & Tri2B），装饰在MCP外壳的外部，将相邻的MCP连接在一起。

HCMV病毒还有SCP（small capsid protein），如图1所示，这些小衣壳蛋白在每个MCP塔顶端，在疱疹病毒中有最大的结构和序列变异。SCP个头不大，却发挥着重要作用：

HCMV病毒复制过程中，一个关键的步骤就是衣壳的组装和成熟。衣壳需要在细胞质中经历一系列复杂的变化，才能最终成熟并释放出病毒。在这个过程中，pp150蛋白发挥着至关重要的作用，它像“门把手”一样，连接着衣壳的SCP和Tri，并与其他蛋白相互作用，维持衣壳的稳定性和功能（见图1）。该团队之前的研究观察到SCP介导pp150-衣壳结合，但是SCP和pp150之间的界面尚未被彻底表征，并且仍然不清楚哪些残基或结构域与pp150-衣壳结合有关。

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如图2所示，HCMV的原子模型呈现一个相对较小的（~446 Å2）pp150- SCP界面，由互补的疏水或极性氨基酸簇组成。

根据以上结构，团队引入突变，将每个互补簇替换为非互补簇，并以GFP为信号，转染细胞进行验证。结果显示，pp150- SCP界面外的簇突变对病毒复制没有可观察到的影响，然而如下图的GFP荧光信号所示，在界面的任何极性或疏水性区域（包括pp150的N248和N252附近）的突变对病毒是致命的。

下表列出了在转染细胞中观察到的簇突变及其对病毒复制的影响。

接下来，团队进一步探究观察到的产生致死型和减毒型的原因是否在于pp150-SCP相互作用的破坏。

为此，团队将pp150-血凝素（HA）和FLAG-SCP标记蛋白克隆到pcDNA3表达载体中，并将WT和突变基因的质粒共转染到ARPE-19细胞中，固定用于免疫荧光测定（IFA）。如图4A显示，IFAs显示WT SCP与WT pp150共定位为转染的ARPE-19细胞的胞浆点（黄色）。相比之下，含有致命SCP或pp150突变体的质粒表现出分散在整个细胞质中的离域信号。pp150-C4突变病毒表现出与WT相似的SCP共定位，表明pp150-C4尽管复制减弱，但仍容易与SCP关联。这一发现与K255E突变通过破坏pp150-MCP界面驱动减毒的观点是一致的。

为了证实IFA的结果，以上质粒被共转染到HEK-293细胞中进行共免疫沉淀试验。如图4B所示，在对照组WT中，免疫印迹很容易检测到FLAG标记的SCP；但致死突变未显示FLAG信号。通过比较，pp150-C4显示出与WT一致的SCP信号，进一步支持了我们的假设，即相互作用没有中断。

总之，这些发现表明，致命的簇突变是那些破坏pp150-SCP界面的突变，即，直接涉及pp150-SCP界面的保守极性或疏水结构域的氨基酸取代对病毒复制有害，这些影响可直接归因于pp150-SCP关联的破坏。而破坏其他界面可以产生减毒的突变。

为了表征pp150-C4突变体的pp150-MCP相互作用受损，会对细胞内的病毒组装和复制产生什么影响，团队使用荧光激活细胞分选（FACS）对GFP信号进行门控，富集pp150-C4突变体感染的HCMV细胞。将这些pp150- C4感染的细胞固定，包埋在树脂中，并用于生成超薄切片（~55 nm）用于透射电镜（TEM）分析。这些超薄切片被转移到碳支持膜涂层的TEM网格上并染色。根据电镜观察的外观，鉴定了核膜，并将衣壳群体分为三组，如图5所示，包括（A-，白色箭头）空衣壳，（B-，白色带黑色轮廓箭头）含支架蛋白衣壳和（C-，黑色箭头）基因组填充衣壳。

与A-衣壳相比，WT细胞核中B-和C-衣壳的比例更高，这种分布在pp150-C4感染的细胞中也相似。除了衣壳分布与WT相似外，pp150-C4感染的细胞还具有与vAC相关的病毒产物，包括包膜的C-衣壳，这表明与pp150缺失突变体不同，这些pp150氨基酸突变体病毒成熟效率高。

先前的研究表明，pp150缺失使HCMV无法在细胞质阶段成熟，很少观察到细胞质衣壳和高度囊化的vAC。相比之下，团队的pp150-C4突变体HCMV尽管对病毒传播有显著的衰减，但似乎能够有效地进行基因组包装、核出口和vAC形成。这似乎表明，此研究结果中pp150-C4产生的完整病毒粒子具有显著降低的传染性，可能为开发减毒活疫苗提供新的平台。

因为pp150缺乏可识别的核定位信号或标志，所以目前尚不清楚pp150如何转运到细胞核中，以及其是与细胞核还是胞质的衣壳结合的。事实上，先前的研究已经证明了核衣壳在没有pp150的情况下具有核输出能力。在发现pp150-C4-HCMV在vAC形成方面没有明显缺陷后，研究团队试图确定pp150是否被正确地整合到突变病毒的核衣壳中。

由于pp150-C4病毒的复制效率低，因此从培养基中纯化完整病毒体的工作变得复杂，需要改进培养程序来纯化被感染细胞的核衣壳。与图6左侧的WT型HCMV类似，右侧显示的从细胞核中纯化的pp150-C4型HCMV核衣壳主要是A -衣壳或B -衣壳，与先前的发现一致。

考虑到pp150和SCP在病毒感染期间在相似的时间点表达，可以想象这些相互作用同样发生在病毒感染的细胞中。由于SCP被认为是通过支架蛋白和MCP一起运送到细胞核的， 团队猜测，pp150与该复合体的细胞质关联将为核运输提供一种合理的机制。

如图6，团队发现了关于pp150蛋白在核衣壳体中分布的有趣现象：

WT和pp150- C4突变体样本的初始冷冻电镜（Cryo-EM）衣壳重建显示，WT病毒粒子中pp150占据的位置没有明显的密度（图6 B和C）；含有C-衣壳的一小部分基因组的3D重建也缺乏pp150密度（图6-2）；意味着在野生型病毒粒子中，pp150蛋白会覆盖在衣壳蛋白上，形成一层保护层。然而，在pp150-C4突变体核衣壳体中缺失了pp150蛋白。

虽然这些发现与先前报道的结构一致，但仔细检查核衣壳的冷冻电镜图像发现MCP塔之间明显存在空白；相比之下，在病毒粒子的低温电镜显微照片中，pp150的被膜使我们无法区分MCP塔。进行深入的数据处理和三维重建后，如下图展示其低温电镜密度对应于pp150和tRNA，与先前发表的结构相似，观察到与WT类似的被皮的衣壳图像，表明突变体中pp150-衣壳关联。

尽管有证据表明pp150在感染细胞的细胞核中形成，但先前对无基因组、细胞核来源的HCMV核衣壳的结构研究表明pp150不存在。团队同样观察到，大多数核衍生衣壳在低温电镜图像和3D重建中缺乏被膜。奇怪的是，低温电镜重建也揭示出，从核中纯化的C-衣壳，通常被认为是pp150关联的最有可能的候选者，也缺乏pp150被膜。

团队对此进行了讨论：通过冷冻电镜图像可以观察到，大约8%和4%的A-和B -衣壳分别具有由pp150和tRNA组成的被膜。由于细胞核衍生的C-衣壳是出了名的不稳定，而且在感染细胞中，A-衣壳只占病毒颗粒的一小部分，团队合理地假设，在纯化的样品中，许多A-衣壳来自基因组较早产生的C-衣壳。因此观察到的更大比例的被膜A-衣壳可能反映了pp150与C-衣壳的优先结合。

在疱疹病毒中，病毒粒子组装是一个由病毒特异性蛋白驱动的严格调控过程，使其成为药物开发的一个有吸引力的靶标。β-疱疹病毒特异性被膜蛋白pp150是细胞质组装的组成部分，需要核衣壳结合才能发挥其功能。

当代HCMV减毒活疫苗候选物依赖于低致病性实验室菌株的功能获得，然而，这些菌株含有基因突变和缺失，可能不可预测地影响诱导免疫反应的保真度。而本文报道的工作代表了首次用结构引导设计和BAC诱变进行致命和减毒HCMV突变，并对其鉴定，并提出了关于pp150-SCP和pp150-MCP相互作用在病毒复制中的作用的重要问题。

本研究结论的优势之处在于：

随着结构生物学和分子生物学技术的不断发展，相信未来会有更多关于pp150蛋白的研究成果出现，为战胜HCMV病毒提供新的武器。鑫研微末团队依托自主研发的冷冻电镜技术，专注提供结构生物学研究服务，实现目标蛋白原子级高分辨率的结构解析。鑫研微末团队在冷冻电镜技术方面积累了大量算法与专利，可提供“高难度结构解析有解决方案，低难度结构解析更迅速、价格更优惠”的技术服务。展望未来，鑫研微末将继续致力于冷冻电镜技术的研发和创新，持续推出更多切合客户需求的结构解析解决方案。

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