npj Drug Discov.｜用于GPCR的基于结构的药物发现

基于结构的药物发现(Structure-based drug discovery, SBDD)利用蛋白靶标的三维结构确定及优化临床阶段前的化合物。

SBDD的四个关键环节如下：1)受体建模，构建或选择靶标受体的三维结构模型；2)配体结合受体复合物建模，生成配体构象及受体适合配体结合的构象；3)hit筛选，发现初始活性化合物；4)hit到先导化合物的优化，优化化合物的效力和药物性质。

图1 基于结构的药物发现关键环节及方法

靶标蛋白在相关功能状态下的精确三维结构是SBDD的核心组成部分。然而，对于GPCRs来说，高分辨率的实验结构稀缺，限制了SBDD的应用。

自2020年以来，人工智能方法在蛋白质结构预测方面取得了突破性的进展，如AlphaFold2(AF2)和RoseTTAFold在CASP14竞赛中的表现接近实验精度。这些基于人工智能的结构预测算法都是在蛋白质数据库(Protein Data Bank, PDB)中已知的实验结构上训练的，因此如果没有PDB中实验GPCR结构数量的爆炸性增长，GPCR就不会成功。截至2025年3月，实验确定的结构已经解决了大约四分之一的GPCR超家族(约800个GPCRs中有235个)，但AF2模型可用于所有超家族成员，包括其最大的子家族Class A(674受体, 图2)。

图2 Class A GPCR AF2模型的置信度以及几何精确度

早期配体对接方法通过将配体柔性构象对接到刚性受体结合口袋，评分并排序配体构象。该对接方法的成功高度依赖于结合口袋的准确性，以及其形状是否适配于所研究配体。它还取决于配体的类型，例如具有多个可旋转键的配体(如肽类)更具挑战性。在对接中固定受体结构有利于计算效率，但会忽略受体在配体结合时可能发生的重要构象重排，即诱导契合。随后，研究人员发现，AF2虽然提高了GPCR结构预测精度，但仍然难以直接用于高精度配体对接。经过一系列尝试(如对结构进一步优化、加入功能状态信息、引入侧链柔性等)，最终AF2模型的表现能优于传统同源建模。

GPCR Dock是权威的结构预测比赛，检验AF2等工具在真实盲测中的表现。GPCR Dock 2021发现，AlphaFold-Multimer所实现的共折叠策略在预测大分子天然肽类配体复合物的几何结构方面，基本解决了包括受体诱导契合和配体柔性等关键挑战。然而，对于小分子配体复合物，这些问题仍未得到解决。因此，计算结构生物学界从那以后一直在探索类似的方法能够准确预测小分子配体在受体中的构象，以及受体口袋结构的相应重排。

近几年间，多个用于与小分子化合物和非蛋白质生物分子(如离子、核酸)形成复合物的端到端方法陆续发布，代表方法包括DiffusionProteinLigand,NeuralPlexer, RosettaFold-AllAtom，以及AlphaFold3(AF3)。这些新方法均基于扩散模型的共折叠，其目标是克服之前由于受体结合位点不准确或构象不合理，导致配体对接效果不佳的问题。考虑到AF3的使用条款限制，许多学术机构和产业团队纷纷开发了自家版本，包括ChaiDiscovery的Chai-1，Iambic Therapeutics的NeuralPlexer 2和3 beta，Ligo Biosciences的AlphaFold3，百度的HelixFold3，字节跳动的Protenix，Umol，Boltz-1。

不同共折叠方法在预测受体-配体复合物几何结构方面的准确性差异很大，并且高度依赖所使用的评估基准。另一个关键问题是预测结构的物理合理性。基于扩散模型的方法经常生成一些违反键长和键角限制的非物理模型，还可能出现分子内或分子间的立体冲突，这很可能是由于训练过程中对特定数据子集的过拟合所致。与AF2不同，这些非物理错误并不能总是通过模型松弛有效去除。与这些观察一致，作者尝试使用扩散共折叠方法复现部分GPCR Dock复合物结构时，也取得了好坏参半的结果，部分模型中存在非物理性的受体内部或受体-配体相互作用(图5a,c)，并且预测的几何精度也存在较大波动(图5b,d,e-j)。

图5 dopamine D3 receptor-eticlopride与GPR139-JNJ复合物的模型预测结果

考虑到当前AI端到端复合物结构预测的局限，基于物理的建模方法依然是预测GPCR与小分子配体复合物结构(特别是建模诱导契合)的关键工具。此类方法包括：集成对接与打分以及IFD-MD方法论(结合蛋白结构预测、基于药效团的配体对接、刚性受体对接及显式溶剂分子动力学模拟)。研究还报道了将传统力场打分方法与深度学习结合，进行配体构象预测与优化的成功案例，这表明人工智能与物理建模的协同或许是未来的最优路径。

在药物发现流程中的初筛阶段，目标是找到具有新颖骨架结构，并对靶标蛋白表现出可测效力和所需药效的化合物。计算方法主要包括两类：基于配体的方法和基于结构的虚拟配体筛选。基于配体的方法利用已知化合物的二维或三维药效团进行筛选，这种方法往往只能发现与已有结构相似的新化合物，因此在骨架多样性和化学类型上存在局限。而基于结构的虚拟配体筛选(structure-based virtual ligand screening，VLS)依赖一个或多个靶点受体结合口袋的三维结构模型，能够发现更多结构新颖、类型多样的配体。VLS的成功率在很大程度上取决于所使用的三维模型的质量。对于GPCRs，如果使用高分辨率实验结构进行VLS，hit率可高达约60%。而基于计算预测结构模型的VLS，一般来说hit率较低，筛出的配体亲和力也较弱。

回顾性虚拟筛选(retrospective VLS)是目前评估结构模型在VLS中表现的主流方法。具体而言，让模型区分少量已知活性化合物和大量诱饵化合物，其中诱饵化合物与活性分子在理化性质(如大小、电荷、柔性)上相似，但在结构上无关。常用的构建诱饵集合的工具是DUDe数据库。通过比较模型在该任务中对已知活性物质与诱饵的打分能力，便可评价模型的虚拟筛选表现。这种能力不仅可以用来预测模型在前瞻性筛选中的成功率，而且据报道它还与模型能否预测出活性分子的几何正确构象相关。但模型可能对已有骨架有偏向，不利于新骨架的发现。因此，实际筛选中建议引入一些未经回顾性验证的新模型以提升化学多样性。

考虑到AF2所预测的GPCR-配体复合物在几何结构上的准确性已有显著提升，人们对其在基于结构的先导化合物筛选中取得更好成功率也抱有期望。已有研究结果表明，未经优化的AF2模型倾向表示apo状态，结合位点结构往往是坍塌的，因此并不适合直接用于VLS。通过侧链重建、结合位点建模等方法对AF2模型进行精修后，能显著提升筛选效果。另外，由Lyu等人开展的大规模VLS比较实验发现AF2模型在回顾性VLS中表现较差，且结合位点的侧链构象变化明显，但在前瞻性识别新配体方面依然非常有效。

打分函数决定VLS排名质量，是虚拟筛选流程中关键但常被忽略的环节。传统的基于物理力场的打分函数，考虑了众多物理因素，如形状互补性(范德华力)，电荷互补性，氢键作用，构象应变等。这些基于力场的打分函数在使用高分辨率的实验结构时有优异的表现但对结构误差敏感。随着人工智能技术的兴起，近年来出现了许多基于深度学习的打分函数，包括EquiScore,AtomNet,RTMScore,RTCNN,IGModel, RosettaVS。这类AI打分函数在各种基准测试中，几乎总是表现出优于传统物理模型的筛选效果，主要是因为它们对构象偏差更具容错性，但常存在过拟合与非物理惩罚机制不足问题。这些AI打分方法在GPCR药物发现中的应用尚处初期，但有潜力提高对建模误差的鲁棒性。

除结构预测与复合物打分外，AI也越来越多地被用于满足对超大规模化合物库(十亿级)的筛选需求，例如MolPAL,Active Learnig Glide,DeepDock,OpenVS, GigaScreen,CP framework。其核心思路是先对化合物库中小部分进行对接与打分，利用结果训练一个靶点特异的神经网络，基于化合物2D结构预测结合分数，随后将神经网络应用于整个数据库，再对打分靠前的小部分化合物进行重新对接与打分。重复此流程直至收敛或神经网络出现过拟合迹象。这种AI加速流程在膜蛋白筛选中已被证明其强大潜力。不过，目前尚未见到它在GPCR上的前瞻性应用实例。

近年来，越来越多的研究开始使用生成式AI进行配体发现，这种方法可以绕过传统化合物库筛选的挑战，并在先导化合物发现中作为VLS的补充。Powers等人利用SE(3)等变图神经网络，直接在受体结合口袋中生成分子结构。实验结果表明它在多个靶点(包括GPCR)中表现出比传统虚拟筛选更好的配体打分、更好的类药性以及更优的药代动力学性能。另外，Thomas等人以多巴胺D2受体为例发现，生成的分子不仅具有更好的预测结合亲和力，而且在理化性质上与已知D2激动剂呈现明显差异。生成式AI正成为配体发现的新兴工具，它可以直接设计具有理想性质的分子，有望克服传统筛选的瓶颈。

在药物发现的hit转先导化合物和先导化合物优化阶段，目标是通过对hit或先导化合物的骨架进行结构修饰，优化药物性质，如靶点结合活性，脱靶选择性，以及药代动力学性质。这一过程预测候选分子的活性或结合亲和力，依赖于构建配体-靶点复合物结构模型进行评估。这类模型必须能识别细微结构变化带来的活性变化。即使是现有的最优AI打分模型也很难对同系化合物准确排序其亲和力。

自由能微扰(FEP)是一种基于分子动力学和炼金变换的物理计算方法，常用于基于结构的结合自由能预测，尤其适用于对配体骨架做微小改动的结构优化。这一过程通过模拟两个配体之间的炼金变换来实现，在溶液中和靶标结合口袋中分别进行，并沿着整个变换路径对复合物构象进行分子动力学取样。目前已实现该方法的软件有GROMACS,YANK,Schrödinger的FEP+。在多类靶点中，使用晶体结构对FEP+进行回顾性验证发现，其在相对结合自由能预测方面的准确性几乎可与实验数据相媲美,但在前瞻性应用中，即用于预测尚未测试的新化合物，FEP的实际预测误差往往较高。

近年来，多个研究团队尝试利用机器学习方法来预测相对结合自由能，但预测精度偏低，且泛化能力较差。一些融合了物理知识的AI模型(如PBCNet、IGModel)可能有更好的预测准确性与可解释性。但这些模型的预测精度依然明显低于物理力场方法,如FEP+，可能因为它们忽略了配体结合时结合口袋构象的变化。因此，在亲和力预测领域，基于物理的方法仍是标准。

作者强调使用不充分或不合适的活性数据集进行回顾性RB-FEP评估，可能会误导模型的有效性判断。比如，如果使用的活性数据分布稀疏、范围狭窄，甚至一个几何结构偏差较大的模型也可能得到较高的RB-FEP预测准确性，但其前瞻性应用可能失败。除了RB-FEP，还可以使用绝对结合自由能计算(AB-FEP)来评估模型是否适合用于配体优化的前瞻性研究。对比于RB-FEP只采样配体之间的微小结构变更，AB-FEP则对单个配体在整个口袋中的“出现”和“消失”进行模拟（在口袋和溶液中），另外AB-FEP不依赖同源化合物以及活性数据，只需一个配体即可进行预测。在多个模型都表现出相似的RB-FEP预测性能时，可以通过AB-FEP来进一步优先选择更可靠的模型用于前瞻性研究。