在肿瘤药理学与精准治疗领域，天然产物因其结构多样性和生物活性广谱性，始终是创新药物研发的核心领域之一。然而，天然产物作用靶点模糊、机制解析困难的问题，长期制约着其从“传统应用”向“现代精准药物”的转化。与此同时，雌激素受体阳性（ER+）乳腺癌作为女性发病率最高的恶性肿瘤亚型（占比70%-80%），虽以内分泌治疗为基石，但约30%患者会发展为他莫昔芬耐药，复发后肿瘤侵袭性显著增强，成为临床治疗的“卡脖子”难题。

近期，中南大学药学院联合中南大学湘雅医院、中南大学湘雅二医院、四川大学华西医院等团队发表于《Nature Communications》的研究论文“Harnessing artificial intelligence to identify Bufalin as a molecular glue degrader of estrogen receptor alpha”，通过AI驱动的靶点预测-多维度实验验证-分子机制解析-临床前疗效评估的系统研究框架，首次揭示传统中药活性成分蟾毒灵（Bufalin）作为“分子胶”降解ERα的全新机制，并证实其可有效逆转他莫昔芬耐药，为ER+乳腺癌治疗提供了兼具“传统智慧”与“现代科技”的新策略。

一、研究设计：破解天然产物靶点难题的“AI+实验”双轮驱动体系

天然产物的靶点鉴定是药物研发的关键瓶颈，传统实验筛选方法存在周期长、成本高、通量低的局限。本研究创新性地构建了“计算预测-实验验证-机制深挖”的三阶研究体系，核心在于将AI技术与分子生物学实验深度融合，实现靶点的精准定位与机制的系统解析。

图1. 基于组合靶点筛选策略探索蟾毒灵的药理机制。该图系统展示了蟾毒灵潜在靶点的筛选流程，包含五个核心部分：a 概述了靶点预测的完整流程，从初始预测到最终验证形成闭环；b 呈现 FMBS 方法与 Swiss Target Prediction、SEA、PPB2、ChEMBL33 四个平台预测靶点的交集，通过交集筛选初步获得 53 个候选靶点；c 是 53 个候选靶点的 KEGG 富集分析气泡图，以 - log (pvalue) 和计数为维度，突出与癌症相关的显著通路；d 可视化 KEGG 分析筛选出的癌症相关通路及其对应靶点，最终确定 11 个关键靶点；e 展示基于 11 个关键靶点构建的多任务神经网络模型，通过该模型筛选出 CYP17A1、ESR1、mTOR、AR、PRKCD 5 个高置信度潜在靶点，为后续实验验证指明方向。
图1. 基于组合靶点筛选策略探索蟾毒灵的药理机制。该图系统展示了蟾毒灵潜在靶点的筛选流程，包含五个核心部分：a 概述了靶点预测的完整流程，从初始预测到最终验证形成闭环；b 呈现 FMBS 方法与 Swiss Target Prediction、SEA、PPB2、ChEMBL33 四个平台预测靶点的交集，通过交集筛选初步获得 53 个候选靶点；c 是 53 个候选靶点的 KEGG 富集分析气泡图，以 - log (pvalue) 和计数为维度，突出与癌症相关的显著通路；d 可视化 KEGG 分析筛选出的癌症相关通路及其对应靶点，最终确定 11 个关键靶点；e 展示基于 11 个关键靶点构建的多任务神经网络模型，通过该模型筛选出 CYP17A1、ESR1、mTOR、AR、PRKCD 5 个高置信度潜在靶点，为后续实验验证指明方向。

（一）AI介导的多维度靶点预测：从“广谱筛选”到“精准聚焦”

研究团队首先针对蟾毒灵的靶点预测设计了整合式多策略模型，以解决单一预测平台的局限性：

  1. 1. 初始靶点池构建：采用融合多生物特征（FMBS）策略，结合Swiss Target Prediction、SEA、PPB2、ChEMBL33四大主流靶点预测平台，利用不同算法的互补性生成初始靶点数据集，通过交集筛选获得53个高可信度候选靶点，初步缩小研究范围；
  2. 2. 通路富集优化：对53个候选靶点进行KEGG通路富集分析，聚焦与肿瘤发生发展直接相关的信号通路（如乳腺癌通路、癌症中的胆碱代谢、PI3K-AKT通路等），通过弦图可视化通路-靶点关联关系，进一步筛选出11个关键靶点；
  3. 3. 多任务QSAR模型验证：基于Chemprop框架构建多任务定量构效关系（QSAR）神经网络模型，以11个关键靶点的1187个化合物结合数据为训练集（80%训练/20%测试），模型ROC-AUC达0.94，具备高预测准确性。以0.8为概率阈值，最终确定CYP17A1、ESR1（编码ERα）、mTOR、AR、PRKCD为5个核心潜在靶点。

该预测体系的优势在于：通过“多平台整合-通路过滤-AI建模验证”的层层递进，既避免了单一算法的偏差，又通过生物学意义筛选确保靶点与肿瘤的关联性，为后续实验验证提供了明确方向。

（二）实验验证：从“体外结合”到“细胞功能”的全维度确认

针对AI预测的5个靶点，研究团队通过阶梯式实验验证，明确ERα为蟾毒灵的核心作用靶点：

  1. 1. 亲和力排序（SPR实验）：采用表面等离子体共振（SPR）技术检测蟾毒灵与重组CYP17A1、ESR1、PRKCD蛋白的结合能力，结果显示ERα与蟾毒灵的解离常数（KD=5.42×10⁻⁶ M）远低于CYP17A1（2.94×10⁻² M）和PRKCD（1.29×10⁻² M），证实ERα是三者中结合亲和力最强的靶点；
  2. 2. 特异性验证（Biotin pulldown实验）：合成生物素标记的蟾毒灵（Biotin-Bufalin），在293T细胞（过表达ERα）和MCF-7细胞（内源性ERα）中进行下拉实验，结果显示Biotin-Bufalin可特异性捕获ERα，且结合具有剂量依赖性，游离蟾毒灵可竞争性抑制该结合，排除非特异性相互作用；
  3. 3. 功能相关性验证（CETSA与共定位实验）：热位移实验（CETSA）显示蟾毒灵可使ERα的熔解温度（Tm）升高2.17℃，表明其可稳定ERα蛋白构象；免疫荧光实验观察到蟾毒灵（FITC标记）与ERα在MCF-7细胞核内共定位，进一步证实两者在细胞内的直接相互作用。

这一系列实验从“体外分子结合”到“细胞内定位与构象影响”，形成了完整的证据链，明确ERα是蟾毒灵在ER+乳腺癌中的关键作用靶点，为后续机制研究奠定基础。

图2. 蟾毒灵与雌激素受体 α（ERα）的直接相互作用验证。该图通过一系列实验证实蟾毒灵与 ERα 的特异性结合，a、b、c 分别为表面等离子体共振（SPR）实验结果，显示蟾毒灵与重组 ESR1（ERα 编码基因产物）、PKC delta（PRKCD 编码蛋白）、CYP17A1 蛋白的结合信号，数据表明蟾毒灵与 ESR1 的结合亲和力最强（KD=5.42E-06 M）；d、e 为生物素 - 蟾毒灵（Biotin-Bufalin）下拉实验结果，分别在转染 ERα 质粒的 293T 细胞和内源性表达 ERα 的 MCF-7 细胞中，证实 Biotin-Bufalin 可特异性捕获 ERα；f 显示 Biotin-Bufalin 与 ERα 的结合具有剂量依赖性；g 表明游离蟾毒灵可竞争性抑制 Biotin-Bufalin 与 ERα 的结合；h 为热位移实验（CETSA）结果，显示蟾毒灵可提高 ERα 的热稳定性（ΔTm=2.17℃）；i 为免疫荧光染色结果，观察到蟾毒灵（FITC 标记）与 ERα 在 MCF-7 细胞内共定位，从多维度证实两者直接且特异性的相互作用。
图2. 蟾毒灵与雌激素受体 α（ERα）的直接相互作用验证。该图通过一系列实验证实蟾毒灵与 ERα 的特异性结合，a、b、c 分别为表面等离子体共振（SPR）实验结果，显示蟾毒灵与重组 ESR1（ERα 编码基因产物）、PKC delta（PRKCD 编码蛋白）、CYP17A1 蛋白的结合信号，数据表明蟾毒灵与 ESR1 的结合亲和力最强（KD=5.42E-06 M）；d、e 为生物素 - 蟾毒灵（Biotin-Bufalin）下拉实验结果，分别在转染 ERα 质粒的 293T 细胞和内源性表达 ERα 的 MCF-7 细胞中，证实 Biotin-Bufalin 可特异性捕获 ERα；f 显示 Biotin-Bufalin 与 ERα 的结合具有剂量依赖性；g 表明游离蟾毒灵可竞争性抑制 Biotin-Bufalin 与 ERα 的结合；h 为热位移实验（CETSA）结果，显示蟾毒灵可提高 ERα 的热稳定性（ΔTm=2.17℃）；i 为免疫荧光染色结果，观察到蟾毒灵（FITC 标记）与 ERα 在 MCF-7 细胞内共定位，从多维度证实两者直接且特异性的相互作用。

二、核心机制：蟾毒灵作为“分子胶”促进ERα泛素-蛋白酶体降解的全新范式

明确ERα为靶点后，研究团队围绕“蟾毒灵如何调控ERα功能”展开深入探究，最终揭示其作为分子胶增强ERα与E3泛素连接酶STUB1相互作用、诱导ERα降解的全新机制，这也是本研究最核心的科学突破。

（一）ERα降解的调控方式：泛素-蛋白酶体途径的特异性激活

首先，研究通过剂量/时间依赖性实验与通路抑制剂干预，明确蟾毒灵对ERα的调控为“转录后降解”：

  1. 1. 降解特征：Western blot显示，蟾毒灵以剂量（0-100 nM）和时间（0-48 h）依赖性方式降低MCF-7、T47D细胞中ERα蛋白水平，但qPCR结果显示ERα mRNA表达无显著变化，排除转录抑制机制；
  2. 2. 降解途径确认：环己酰亚胺（CHX，蛋白合成抑制剂）追踪实验显示，蟾毒灵可加速ERα蛋白降解速率；蛋白酶体抑制剂MG-132可完全逆转蟾毒灵诱导的ERα下调，而溶酶体抑制剂羟氯喹（HCQ）无明显作用；泛素激活酶抑制剂MLN4924同样可减弱ERα降解，提示降解依赖泛素-蛋白酶体途径；
  3. 3. 泛素化水平验证：共免疫沉淀（Co-IP）实验显示，蟾毒灵处理后，ERα的泛素化修饰水平显著升高（以HA-Ub或Flag-ERα为靶点检测），直接证实其通过促进ERα泛素化实现降解。
图3. 蟾毒灵诱导 ERα 降解并抑制其转录活性。该图围绕蟾毒灵对 ERα 的调控效应展开，a 为 Western blot 结果，显示 MCF-7 和 T47D 细胞经不同浓度蟾毒灵处理 48 小时后，ERα 蛋白水平呈剂量依赖性降低；b 显示同一细胞系经 50 nM 蟾毒灵处理不同时间后，ERα 蛋白水平呈时间依赖性降低；c 为环己酰亚胺（CHX）追踪实验结果，证实蟾毒灵可加速 ERα 蛋白降解；d、e 表明蛋白酶体抑制剂 MG-132 和泛素激活酶抑制剂 MLN4924 可逆转蟾毒灵诱导的 ERα 下调，而 f 显示溶酶体抑制剂羟氯喹（HCQ）无此效应，提示 ERα 降解依赖泛素 - 蛋白酶体途径；g、h 为共免疫沉淀（Co-IP）实验结果，证实蟾毒灵可增强 ERα 的泛素化水平；i 为 ERE 荧光素酶报告基因实验结果，显示蟾毒灵可抑制 ERα 的转录活性；j 为 qPCR 结果，表明蟾毒灵可下调 ERα 下游靶基因（AGR2、CCND1、GREB1 等）的 mRNA 表达，全面揭示蟾毒灵对 ERα 的降解作用及对其功能的抑制。
图3. 蟾毒灵诱导 ERα 降解并抑制其转录活性。该图围绕蟾毒灵对 ERα 的调控效应展开，a 为 Western blot 结果，显示 MCF-7 和 T47D 细胞经不同浓度蟾毒灵处理 48 小时后，ERα 蛋白水平呈剂量依赖性降低；b 显示同一细胞系经 50 nM 蟾毒灵处理不同时间后，ERα 蛋白水平呈时间依赖性降低；c 为环己酰亚胺（CHX）追踪实验结果，证实蟾毒灵可加速 ERα 蛋白降解；d、e 表明蛋白酶体抑制剂 MG-132 和泛素激活酶抑制剂 MLN4924 可逆转蟾毒灵诱导的 ERα 下调，而 f 显示溶酶体抑制剂羟氯喹（HCQ）无此效应，提示 ERα 降解依赖泛素 - 蛋白酶体途径；g、h 为共免疫沉淀（Co-IP）实验结果，证实蟾毒灵可增强 ERα 的泛素化水平；i 为 ERE 荧光素酶报告基因实验结果，显示蟾毒灵可抑制 ERα 的转录活性；j 为 qPCR 结果，表明蟾毒灵可下调 ERα 下游靶基因（AGR2、CCND1、GREB1 等）的 mRNA 表达，全面揭示蟾毒灵对 ERα 的降解作用及对其功能的抑制。

（二）分子胶作用的结构基础：Arg394为核心结合位点

为明确蟾毒灵与ERα的结合细节，研究通过分子对接与突变实验，锁定Arg394为关键结合残基：

  1. 1. 分子对接与MD模拟：采用Glide SP协议将蟾毒灵对接至ERα结合口袋（PDB ID: 3ERT），经100 ns分子动力学（MD）模拟与MM-GBSA能量计算，发现Leu354、Leu387、Arg394、Met528、Ala350为能量贡献＞-1 kcal/mol的关键残基；
  2. 2. 丙氨酸扫描突变验证：构建ERα单点突变体（Leu354A、Leu387A、Arg394A、Met528A、Ala350Q），在293T细胞中进行Biotin pulldown实验，结果显示仅Arg394A突变完全丧失与Biotin-Bufalin的结合能力；进一步的降解实验显示，Arg394A突变体的ERα降解效率显著降低，泛素化水平也随之下降。

这一结果表明，Arg394是蟾毒灵与ERα结合的“不可替代位点”，其突变会完全阻断蟾毒灵的后续调控作用，为后续结构优化提供了明确的分子靶点。

图4. 蟾毒灵选择性结合 ERα 的 Arg394（R394）残基。该图聚焦蟾毒灵与 ERα 的结合位点解析，a 展示采用 Glide SP 协议将蟾毒灵对接至 ESR1 结合口袋的分子对接结果；b 为对接形成的 ESR1 - 蟾毒灵复合物经 100 ns 分子动力学（MD）模拟后，通过 MM-GBSA 能量计算和残基能量分解得到的前 10 个关键作用残基；c 为对这 10 个残基进行丙氨酸扫描突变的设计方案；d 为下拉实验结果，在转染 ERα 野生型（WT）或突变体质粒的 293T 细胞中，仅 Arg394A 突变体丧失与 Biotin-Bufalin 的结合能力；e 为 Western blot 结果，显示 Arg394A 突变体的 ERα 降解效率显著降低；f 为 Co-IP 实验结果，证实 Arg394A 突变体在蟾毒灵处理下泛素化水平下降，明确 Arg394 是蟾毒灵与 ERα 结合及诱导 ERα 降解的关键残基。
图4. 蟾毒灵选择性结合 ERα 的 Arg394（R394）残基。该图聚焦蟾毒灵与 ERα 的结合位点解析，a 展示采用 Glide SP 协议将蟾毒灵对接至 ESR1 结合口袋的分子对接结果；b 为对接形成的 ESR1 - 蟾毒灵复合物经 100 ns 分子动力学（MD）模拟后，通过 MM-GBSA 能量计算和残基能量分解得到的前 10 个关键作用残基；c 为对这 10 个残基进行丙氨酸扫描突变的设计方案；d 为下拉实验结果，在转染 ERα 野生型（WT）或突变体质粒的 293T 细胞中，仅 Arg394A 突变体丧失与 Biotin-Bufalin 的结合能力；e 为 Western blot 结果，显示 Arg394A 突变体的 ERα 降解效率显著降低；f 为 Co-IP 实验结果，证实 Arg394A 突变体在蟾毒灵处理下泛素化水平下降，明确 Arg394 是蟾毒灵与 ERα 结合及诱导 ERα 降解的关键残基。

（三）分子胶功能的关键效应：增强ERα与STUB1的相互作用

分子胶的核心功能是“诱导靶点蛋白与E3泛素连接酶的 proximity”，本研究通过MD模拟与功能实验，证实蟾毒灵可增强ERα与STUB1的相互作用：

  1. 1. E3连接酶筛选：基于已有研究，选择与ERα降解相关的E3连接酶（TRIM56、RNF181、RNF2、STUB1）进行MD模拟，结果显示：蟾毒灵存在时，ERα与STUB1的结合自由能从-4.9455 kcal/mol降至-58.1918 kcal/mol，而与其他E3连接酶的结合能无显著变化，提示STUB1是蟾毒灵作用的特异性E3连接酶；
  2. 2. 相互作用增强的结构证据：200 ns MD模拟显示，蟾毒灵结合ERα后，会诱导ERα构象发生细微改变（如Arg394形成氢键），使ERα与STUB1的结合表面积增加、氢键数量增多（模拟后期氢键数达3-4个），且ERα-STUB1复合物的RMSD值更稳定（＜3.5 Å），表明复合物构象更稳定；
  3. 3. 功能验证（STUB1沉默实验）：在MCF-7、T47D细胞中沉默STUB1后，蟾毒灵诱导的ERα降解效率显著降低，ERα泛素化水平也随之下降；Co-IP实验进一步证实，蟾毒灵可显著增强ERα与STUB1的相互作用。

这些结果清晰揭示：蟾毒灵通过“分子胶”机制，一方面与ERα的Arg394结合，另一方面诱导ERα构象改变以增强其与STUB1的相互作用，最终促进ERα泛素化降解——这是天然产物中罕见的分子胶作用模式，为分子胶药物的研发提供了新的天然模板。

图5. 蟾毒灵通过增强 ERα 与 E3 连接酶 STUB1 的相互作用促进 ERα 降解。该图揭示蟾毒灵作为分子胶的作用机制，a 展示 ERα 与 STUB1 在有无蟾毒灵存在时的结合构象，其中品红色为蛋白对接结果，绿色为加蟾毒灵后 200 ns MD 模拟聚类构象，蓝色为不加蟾毒灵的模拟构象，黄色棍状结构为蟾毒灵；b 显示 200 ns 模拟时 ERα- 蟾毒灵 - STUB1 复合物的构象变化，蟾毒灵与 ERα 的 Arg394 形成氢键；c 为 ERα-STUB1 复合物的 RMSD 曲线，表明加蟾毒灵后复合物构象更稳定；d 为结合表面积分析，显示蟾毒灵可增加 ERα 与 STUB1 的结合表面积；e 为 RMSF 曲线，表明蟾毒灵可降低 ERα 和 STUB1 结合界面残基的灵活性；f 显示模拟过程中 ERα 与 STUB1 之间氢键数量的变化，加蟾毒灵后氢键数量增多；g 为 Western blot 结果，显示沉默 STUB1 可升高 ERα 水平；h 为 Co-IP 实验结果，证实蟾毒灵可增强 ERα 与 STUB1 的相互作用；i 表明沉默 STUB1 可减弱蟾毒灵诱导的 ERα 降解，证实 STUB1 在蟾毒灵介导的 ERα 降解中不可或缺。
图5. 蟾毒灵通过增强 ERα 与 E3 连接酶 STUB1 的相互作用促进 ERα 降解。该图揭示蟾毒灵作为分子胶的作用机制，a 展示 ERα 与 STUB1 在有无蟾毒灵存在时的结合构象，其中品红色为蛋白对接结果，绿色为加蟾毒灵后 200 ns MD 模拟聚类构象，蓝色为不加蟾毒灵的模拟构象，黄色棍状结构为蟾毒灵；b 显示 200 ns 模拟时 ERα- 蟾毒灵 - STUB1 复合物的构象变化，蟾毒灵与 ERα 的 Arg394 形成氢键；c 为 ERα-STUB1 复合物的 RMSD 曲线，表明加蟾毒灵后复合物构象更稳定；d 为结合表面积分析，显示蟾毒灵可增加 ERα 与 STUB1 的结合表面积；e 为 RMSF 曲线，表明蟾毒灵可降低 ERα 和 STUB1 结合界面残基的灵活性；f 显示模拟过程中 ERα 与 STUB1 之间氢键数量的变化，加蟾毒灵后氢键数量增多；g 为 Western blot 结果，显示沉默 STUB1 可升高 ERα 水平；h 为 Co-IP 实验结果，证实蟾毒灵可增强 ERα 与 STUB1 的相互作用；i 表明沉默 STUB1 可减弱蟾毒灵诱导的 ERα 降解，证实 STUB1 在蟾毒灵介导的 ERα 降解中不可或缺。

三、功能价值：从“细胞活性”到“临床前疗效”的全场景验证

机制解析后，研究团队通过ERα依赖性验证与耐药模型评估，全面证实蟾毒灵的抗肿瘤活性及逆转他莫昔芬耐药的潜力，为临床转化提供了扎实证据。

（一）ERα依赖性：蟾毒灵抗肿瘤活性的核心前提

为明确ERα降解与抗肿瘤活性的因果关系，研究通过ERα沉默/过表达实验进行验证：

  1. 1. 增殖抑制与凋亡诱导：CCK-8和集落形成实验显示，蟾毒灵可显著抑制MCF-7、T47D细胞增殖（IC50分别为20 nM、30 nM）；Annexin V-PI染色显示，50 nM蟾毒灵处理48 h可使凋亡率提升至25%-30%，且凋亡标志物（切割型PARP）表达升高；
  2. 2. ERα依赖性验证：siRNA沉默ERα后，蟾毒灵诱导的细胞凋亡率下降50%以上，增殖抑制效应显著减弱；而过表达ERα的293T细胞对蟾毒灵的敏感性显著增强（IC50降至10 nM）。

这一结果证实：蟾毒灵的抗肿瘤活性完全依赖于ERα的存在，ERα降解是其发挥疗效的核心机制，排除了其他非特异性作用的干扰。

图6. 蟾毒灵对 ER + 细胞的抗肿瘤活性依赖于 ERα。此图验证 ERα 在蟾毒灵抗肿瘤效应中的核心作用，a 为集落形成实验结果，显示不同浓度蟾毒灵可抑制 MCF-7 和 T47D 细胞的集落形成能力；b 为 CCK-8 实验结果，表明蟾毒灵以剂量依赖性方式降低两株细胞的活力；c 为 Annexin V-FITC/PI 染色结果，显示蟾毒灵可诱导 MCF-7 细胞凋亡；d、e 为沉默 ERα（siESR1）后，MCF-7 细胞对蟾毒灵诱导的凋亡敏感性降低；f 为 Western blot 结果，显示沉默 ERα 可减弱蟾毒灵诱导的 PARP 切割（凋亡标志物）；g 为 CCK-8 实验结果，表明沉默 ERα 可降低 T47D 细胞对蟾毒灵的敏感性；h 显示过表达 ERα（Flag-ERα）可增强 293T 细胞对蟾毒灵的敏感性；i 为集落形成实验结果，进一步证实沉默 ERα 可减弱蟾毒灵对 MCF-7 细胞增殖的抑制，明确蟾毒灵的抗肿瘤活性依赖 ERα。
图6. 蟾毒灵对 ER + 细胞的抗肿瘤活性依赖于 ERα。此图验证 ERα 在蟾毒灵抗肿瘤效应中的核心作用，a 为集落形成实验结果，显示不同浓度蟾毒灵可抑制 MCF-7 和 T47D 细胞的集落形成能力；b 为 CCK-8 实验结果，表明蟾毒灵以剂量依赖性方式降低两株细胞的活力；c 为 Annexin V-FITC/PI 染色结果，显示蟾毒灵可诱导 MCF-7 细胞凋亡；d、e 为沉默 ERα（siESR1）后，MCF-7 细胞对蟾毒灵诱导的凋亡敏感性降低；f 为 Western blot 结果，显示沉默 ERα 可减弱蟾毒灵诱导的 PARP 切割（凋亡标志物）；g 为 CCK-8 实验结果，表明沉默 ERα 可降低 T47D 细胞对蟾毒灵的敏感性；h 显示过表达 ERα（Flag-ERα）可增强 293T 细胞对蟾毒灵的敏感性；i 为集落形成实验结果，进一步证实沉默 ERα 可减弱蟾毒灵对 MCF-7 细胞增殖的抑制，明确蟾毒灵的抗肿瘤活性依赖 ERα。

（二）他莫昔芬耐药逆转：从“细胞系”到“PDO”的全维度疗效

针对临床核心需求，研究团队在耐药细胞系、动物模型、患者来源类器官（PDO） 中系统评估蟾毒灵的疗效：

  1. 1. 耐药细胞系（LCC2）中的活性：LCC2细胞是经典的他莫昔芬耐药细胞系，Western blot显示蟾毒灵仍可有效降解LCC2中的ERα；CCK-8、集落形成、EdU实验证实，蟾毒灵以剂量依赖性方式抑制LCC2增殖（IC50=40 nM），且疗效优于氟维司群（IC50=80 nM）；凋亡实验显示，100 nM蟾毒灵可使LCC2凋亡率达35%，显著高于氟维司群（20%）；（图7）
  2. 2. 体内疗效与安全性：在LCC2裸鼠皮下移植瘤模型中，腹腔注射蟾毒灵（0.5 mg/kg、1.0 mg/kg）可使肿瘤体积缩小40%-60%，肿瘤重量降低50%-70%，且肿瘤组织中ERα蛋白水平下降、Ki67（增殖标志物）表达降低；血清生化指标（ALT、AST、BUN、CREA）检测显示，治疗剂量的蟾毒灵对小鼠肝肾功能无显著影响，安全性良好；（图8）
  3. 3. 患者来源类器官（PDO）验证：从8例他莫昔芬复发患者的肿瘤组织中构建PDO模型，结果显示：蟾毒灵（50-200 nM）可使PDO体积缩小50%-80%，细胞活力降低60%-90%；Calcein-AM/PI染色显示，蟾毒灵处理后PDO内死细胞（PI阳性）比例显著升高，证实其在临床样本中的疗效。（图9）

这一系列实验从“体外耐药细胞”到“体内动物模型”，再到“临床患者样本衍生的PDO”，形成了完整的临床前疗效证据链，充分证实蟾毒灵可有效逆转他莫昔芬耐药，且安全性良好，具备极高的临床转化价值。

图7. 蟾毒灵在体外逆转他莫昔芬耐药。该图在他莫昔芬耐药模型中评估蟾毒灵的活性，a 为免疫组化（IHC）结果，显示 8 例他莫昔芬复发患者的肿瘤组织中仍高表达 ERα；b 为 Western blot 结果，显示蟾毒灵可在他莫昔芬耐药细胞 LCC2 中降解 ERα；c 为 CCK-8 实验结果，表明蟾毒灵以剂量依赖性方式降低 LCC2 细胞活力；d 为集落形成实验结果，显示蟾毒灵可抑制 LCC2 细胞集落形成；e 为 EdU 实验结果，显示蟾毒灵可减少 LCC2 细胞的 DNA 合成（增殖指标）；f 为 Western blot 结果，显示蟾毒灵可诱导 LCC2 细胞中 PARP 切割并下调 Bcl-2（抗凋亡蛋白）；g 为 Annexin V-FITC/PI 染色结果，证实蟾毒灵可诱导 LCC2 细胞凋亡；h、i 分别通过集落形成和 CCK-8 实验，表明蟾毒灵对 LCC2 细胞的抑制效应优于氟维司群，证实其在体外可逆转他莫昔芬耐药。
图7. 蟾毒灵在体外逆转他莫昔芬耐药。该图在他莫昔芬耐药模型中评估蟾毒灵的活性，a 为免疫组化（IHC）结果，显示 8 例他莫昔芬复发患者的肿瘤组织中仍高表达 ERα；b 为 Western blot 结果，显示蟾毒灵可在他莫昔芬耐药细胞 LCC2 中降解 ERα；c 为 CCK-8 实验结果，表明蟾毒灵以剂量依赖性方式降低 LCC2 细胞活力；d 为集落形成实验结果，显示蟾毒灵可抑制 LCC2 细胞集落形成；e 为 EdU 实验结果，显示蟾毒灵可减少 LCC2 细胞的 DNA 合成（增殖指标）；f 为 Western blot 结果，显示蟾毒灵可诱导 LCC2 细胞中 PARP 切割并下调 Bcl-2（抗凋亡蛋白）；g 为 Annexin V-FITC/PI 染色结果，证实蟾毒灵可诱导 LCC2 细胞凋亡；h、i 分别通过集落形成和 CCK-8 实验，表明蟾毒灵对 LCC2 细胞的抑制效应优于氟维司群，证实其在体外可逆转他莫昔芬耐药。
图8. 蟾毒灵在体内逆转他莫昔芬耐药。此图在动物模型中验证蟾毒灵的体内疗效与安全性，a 为 LCC2 裸鼠皮下移植瘤实验中，不同处理组（溶剂对照、0.5 mg/kg 蟾毒灵、1.0 mg/kg 蟾毒灵、2.0 mg/kg 氟维司群）的肿瘤实物图；b 图为肿瘤体积生长曲线，显示蟾毒灵可显著抑制肿瘤生长，且高剂量组效果更优；c 为实验终点肿瘤重量统计，证实蟾毒灵可降低肿瘤重量，疗效优于氟维司群；d 为 IHC 结果，显示蟾毒灵处理组肿瘤组织中 Ki67（增殖标志物）表达降低；e 为 H&E 染色结果，显示蟾毒灵处理组肿瘤细胞排列松散、细胞核缩小，提示细胞增殖受抑；f 为 IHC 结果，显示蟾毒灵处理组肿瘤组织中 ERα 表达降低；g 为 Western blot 结果，进一步证实蟾毒灵可在体内降低 ERα 蛋白水平；h、i 为小鼠血清生化指标（肝肾功能相关）检测结果，显示治疗剂量的蟾毒灵对小鼠肝肾功能无显著影响，安全性良好。
图8. 蟾毒灵在体内逆转他莫昔芬耐药。此图在动物模型中验证蟾毒灵的体内疗效与安全性，a 为 LCC2 裸鼠皮下移植瘤实验中，不同处理组（溶剂对照、0.5 mg/kg 蟾毒灵、1.0 mg/kg 蟾毒灵、2.0 mg/kg 氟维司群）的肿瘤实物图；b 图为肿瘤体积生长曲线，显示蟾毒灵可显著抑制肿瘤生长，且高剂量组效果更优；c 为实验终点肿瘤重量统计，证实蟾毒灵可降低肿瘤重量，疗效优于氟维司群；d 为 IHC 结果，显示蟾毒灵处理组肿瘤组织中 Ki67（增殖标志物）表达降低；e 为 H&E 染色结果，显示蟾毒灵处理组肿瘤细胞排列松散、细胞核缩小，提示细胞增殖受抑；f 为 IHC 结果，显示蟾毒灵处理组肿瘤组织中 ERα 表达降低；g 为 Western blot 结果，进一步证实蟾毒灵可在体内降低 ERα 蛋白水平；h、i 为小鼠血清生化指标（肝肾功能相关）检测结果，显示治疗剂量的蟾毒灵对小鼠肝肾功能无显著影响，安全性良好。
图9. 蟾毒灵在他莫昔芬耐药患者来源类器官（PDO）中具有显著抗肿瘤活性。该图在临床相关模型中验证蟾毒灵的疗效并总结作用机制，a 为他莫昔芬复发患者来源 PDO 经蟾毒灵处理后的代表性图像；b 为 PDO 体积统计结果，显示蟾毒灵以剂量依赖性方式缩小 PDO 体积；c 为 PDO 活力检测结果，表明蟾毒灵可降低 PDO 细胞活力；d 为 Calcein-AM/PI 荧光染色结果，显示蟾毒灵处理后 PDO 内死细胞（PI 阳性）比例显著升高，证实其对 PDO 的杀伤效应；e 为机制示意图，总结本研究发现：通过 AI 结合分子对接预测，蟾毒灵可结合 ERα 的 Arg394 残基，作为分子胶增强 ERα 与 E3 连接酶 STUB1 的相互作用，促进 ERα 泛素 - 蛋白酶体降解，进而在体外、体内及 PDO 模型中逆转他莫昔芬耐药，为 ER + 乳腺癌治疗提供新策略。
图9. 蟾毒灵在他莫昔芬耐药患者来源类器官（PDO）中具有显著抗肿瘤活性。该图在临床相关模型中验证蟾毒灵的疗效并总结作用机制，a 为他莫昔芬复发患者来源 PDO 经蟾毒灵处理后的代表性图像；b 为 PDO 体积统计结果，显示蟾毒灵以剂量依赖性方式缩小 PDO 体积；c 为 PDO 活力检测结果，表明蟾毒灵可降低 PDO 细胞活力；d 为 Calcein-AM/PI 荧光染色结果，显示蟾毒灵处理后 PDO 内死细胞（PI 阳性）比例显著升高，证实其对 PDO 的杀伤效应；e 为机制示意图，总结本研究发现：通过 AI 结合分子对接预测，蟾毒灵可结合 ERα 的 Arg394 残基，作为分子胶增强 ERα 与 E3 连接酶 STUB1 的相互作用，促进 ERα 泛素 - 蛋白酶体降解，进而在体外、体内及 PDO 模型中逆转他莫昔芬耐药，为 ER + 乳腺癌治疗提供新策略。

四、研究的科学价值与未来展望

本研究不仅为ER+乳腺癌耐药治疗提供了新的候选药物，更在天然产物机制解析、AI辅助药物研发等领域具有重要的科学意义：

  1. 1. 天然产物靶点解析的范式创新：首次将AI多任务模型与分子生物学实验结合，建立了“预测-验证-机制”的系统框架，解决了天然产物靶点模糊的难题，为其他天然产物的机制研究提供了可推广的方法学参考；
  2. 2. 分子胶药物的新发现：蟾毒灵是首个被证实具有ERα分子胶功能的天然产物，其作用模式（结合Arg394增强ERα-STUB1相互作用）为分子胶药物的设计提供了新的结构模板，突破了传统分子胶多为合成小分子的局限；
  3. 3. 临床转化的明确方向：基于Arg394结合位点，可进一步开展蟾毒灵的结构优化，开发亲和力更强、毒性更低的衍生物；同时，可探索蟾毒灵与CDK4/6抑制剂、免疫检查点抑制剂的联合治疗策略，进一步提升ER+乳腺癌的治疗效果。

综上，该研究通过AI技术赋能天然产物机制解析，不仅揭示了蟾毒灵作为ERα分子胶降解剂的全新作用模式，更为他莫昔芬耐药乳腺癌患者提供了新的治疗希望，是“传统中药现代化”与“精准肿瘤治疗”交叉融合的典范之作。

参考文献

Jiang, S., Liu, K., Jiang, T. et al. Harnessing artificial intelligence to identify Bufalin as a molecular glue degrader of estrogen receptor alpha. Nat Commun 16, 7854 (2025). https://doi.org/10.1038/s41467-025-62288-7

代码：
https://github.com/wei-xiao-ya/multi_task-NN
https://github.com/LiHui-CADD/pro1-pro2-lig/tree/master

 

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