前瞻性发现高效选择性 BTK 共价抑制剂

原文信息
Shamir Y, Gabizon R, Rogel A, Lin DY, Andreotti AH, London N.
Discovery of Covalent Ligands with AlphaFold3.
Journal of the American Chemical Society, 2026.
DOI: 10.1021/jacs.5c22222
通讯作者：Nir London，魏茨曼科学研究所化学与结构生物学系

摘要速读

本文报道了一项里程碑式工作：将 Google DeepMind 的全原子结构预测模型 AlphaFold3（AF3） 首次系统性地应用于共价配体的虚拟筛选（covalent virtual screening），并在前瞻性筛选实验中成功发现了结构全新的 BTK 共价抑制剂。

核心贡献如下：

1. 1. COValid：首个专门用于共价虚拟筛选富集分析的基准数据集（874 个活性分子 + 37,919 个性质匹配诱饵分子）
2. 2. 方法论突破：AF3 的 mPAE 指标在全部 10 个靶点位点均大幅优于传统共价对接工具（71.8% vs ~10%，Adjusted LogAUC）
3. 3. 实验验证：前瞻性筛选发现 YS1，IC₅₀ = 30 nM（体外），107 nM（细胞），晶体结构验证预测精度达 0.50 Å RMSD
   

一、研究背景与科学问题

1.1 共价抑制剂的重要性

共价抑制剂（covalent inhibitors）通过与靶蛋白上的亲核氨基酸残基形成不可逆（或可逆）共价键来发挥作用。相较于非共价抑制剂，其优势包括：

• • 更高效力：持续占据靶点，即使药物浓度降低后仍保持活性
• • 更长靶点占用时间（target engagement）：不受药动学波动影响
• • 潜在的选择性优势：可利用特定位置的半胱氨酸等氨基酸进行精准定向

截至目前，FDA 已批准超过 50 种共价药物，近年代表性品种包括：

1.2 共价虚拟筛选面临的挑战

共价结合是一个两步动力学过程：

E + I  ⇌  E·I  →  E-I（共价加成物）
       KI      kinact

其中：

• • 第一步：可逆非共价识别（KI，由分子识别决定）
• • 第二步：共价键形成（kinact，由反应活性与空间朝向决定）

传统共价对接软件（DOCKovalent、DOCK6、AutoDock 等）存在以下根本性缺陷：

1. 1. 只对已成键的加成物状态（adduct state）打分，完全忽略共价反应前的过渡态空间朝向
2. 2. 无法量化亲电试剂的固有反应活性，导致多弹头共价库（multi-warhead library）的排序不可行
3. 3. 使用固定蛋白骨架，难以处理配体诱导的构象变化（induced-fit effects）
4. 4. 缺乏标准化富集评估基准：非共价筛选领域有 DUD-E、DUDE-Z 等成熟基准，共价领域从未有过

正是这一空白，催生了本文的核心工作。

二、COValid——首个共价虚拟筛选富集基准数据集

2.1 数据集设计原则

COValid 的构建借鉴了非共价领域 DUD-E 的两大核心原则：

原则 1：物化性质匹配（property matching）
诱饵分子与活性分子在以下 6 个性质上保持高度匹配，避免因性质差异导致的人为富集：

• • 分子量（MW）
• • 氢键供体数（HBD）
• • 氢键受体数（HBA）
• • 可旋转键数（rotatable bonds）
• • 净电荷（net charge）
• • 脂水分配系数（cLogP）

原则 2：拓扑不相似性（topological dissimilarity）
通过打乱分子骨架连接方式生成诱饵，确保其与活性分子组成相似但拓扑不同，从而排除因化学相似性导致的假阳性富集。诱饵骨架均选自 ZINC20（商业可及化合物数据库），保证化学合理性。

2.2 数据集组成

注：本研究聚焦于丙烯酰胺（acrylamide）弹头——最常见的靶向半胱氨酸的共价弹头，兼顾实用性与可比较性。

三、AlphaFold3 共价共折叠（Covalent Cofolding）方法

3.1 AF3 的输入与输出

AF3（2024 年 11 月发布）首次实现了全原子生物分子结构预测，支持共价蛋白-配体复合物的预测。

输入：

• • 蛋白质氨基酸序列
• • 配体的几何优化 3D 构象（SMILES → 3D）
• • 共价键指定：配体原子编号 + 蛋白侧链原子

输出：

• • 预测的共价复合物三维坐标
• • 多种置信度指标矩阵（PAE、pTM、ipTM 等）

相比传统对接的关键优势：

• • 无需晶体结构，仅需蛋白序列
• • 允许蛋白骨架柔性（backbone flexibility）
• • 可建模配体诱导的构象变化（如 BTK P-loop 重排）
• • 可暴露隐蔽口袋（cryptic pockets）

3.2 关键指标：mPAE（最小预测对齐误差）

PAE（Predicted Aligned Error）矩阵是 AF3 输出的结构置信度矩阵，其中元素 (i, j) 表示：以 token i 为参考对齐时，token j 位置的预测误差（单位：Å）。

研究者定义：

即：以所有配体原子为参考对齐时，所有蛋白残基位置预测误差的最小值。

mPAE 相较其他置信度指标的优势：

mPAE 的物理意义：反映配体与蛋白之间最紧密接触区域的结构置信度，本质上是对结合界面几何互补性的度量，而非简单的全局置信度。

3.3 mPAE 的绝对值与结合概率

在 COValid 适用范围内，mPAE 的绝对值具有前瞻性筛选意义：

这一单调递减关系为设定筛选截断值（cutoff）提供了理论依据。

四、基准测试结果

4.1 COValid 上的富集性能对比

富集度量指标：Adjusted LogAUC

• • 0%：随机水平
• • 85.5%：理论最优（所有活性分子均排在所有诱饵之前）
• • 强调早期富集（early enrichment），更贴近实际筛选需求

值得注意的细节：

• • AF3 + Rosetta 重打分（纯物理打分，不依赖 AI 置信度指标）已显著优于传统对接，说明 AF3 生成的结构模型物理合理性足够好
• • mPAE 在此基础上进一步大幅提升（28.5% → 71.8%），说明 AF3 内置的置信度信息具有独立的预测价值
• • 各位点 AUC（ROC 曲线下面积）范围：0.9082 ~ 0.9996，几乎接近完美分类

4.2 消融实验：排除训练数据泄露的可能

潜在偏差：AF3 的训练集包含大量 PDB 结构，若测试化合物与训练集重叠，则富集性能可能被高估。

研究者的消融策略：按 Tanimoto 相似性（Morgan 指纹，radius=2，2048 bits）过滤与 PDB 中任何分子相似的活性化合物（及其对应诱饵），在 Tc = 0.4 严格截断下（过滤掉大多数活性分子后），富集性能几乎不受影响。

此外，64 个"实验诱饵"（ChEMBL 中被测试过但活性 > 10 μM 的丙烯酰胺化合物）的 mPAE 均值为 1.5 ± 0.5 Å，与活性分子形成显著区分（86% 的实验诱饵 mPAE > 0.95 Å）。

4.3 非共价虚拟筛选：在 DUDE-Z 上的表现

将 AF3 + mPAE 推广到非共价领域（DUDE-Z 基准，43 个靶点）：

• • 在 42/43 个靶点中，AF3 显著优于 DOCK3.7 和 DOCK6.9
• • 激酶靶点平均 Adjusted LogAUC：60.7 ± 11.1%（优于非激酶靶点的 47.5 ± 21.3%）
• • 与 Boltz-2（另一 AI 共折叠模型）性能相近

五、前瞻性筛选：发现 BTK 全新共价抑制剂

5.1 筛选流程

靶点：BTK（布鲁顿酪氨酸激酶）Cys481，B 细胞恶性肿瘤的重要治疗靶点，已有 Ibrutinib、Zanubrutinib、Acalabrutinib、Rilzabrutinib 等多个 FDA 批准的共价抑制剂。

筛选流程：

构建虚拟库（~906K 含丙烯酰胺化合物）
        ↓
AF3 预测各化合物与 BTK Cys481 的共价复合物结构
        ↓
按 mPAE 排序，保留 mPAE < 0.9 Å 的化合物（440 个，~0.05%）
        ↓
过滤与已知 BTK 抑制剂相似的化合物（Tc > 0.35）
        ↓
聚类分析 + 人工审查（多样结合模式）→ 390 个候选
        ↓
合成 13 个代表性化合物
        ↓
实验评价（LC/MS、激酶抑制、细胞实验、晶体学）

5.2 三个主要苗头化合物

YS1（最优命中）：

• • LC/MS 蛋白标记：在 1 μM / 2 h 条件下达到接近 100% 共价标记率
• • IC₅₀（体外 BTK 抑制）：30 nM
• • IC₅₀（细胞水平，Mino 细胞）：107 nM（BTK 自磷酸化抑制）
• • 选择性：激酶组学（362 个激酶，300 nM）仅 6 个激酶抑制 > 40%（3 个为 TK 组家族成员：JAK3 85.1%、BMX 95.3%、TEC 45.6%）
• • 蛋白质组学选择性：Probe 4 竞争实验中，全细胞蛋白质组（3416 个蛋白）中仅 TEC 激酶显著被竞争
• • kinact/KI = 915.85 M⁻¹s⁻¹；kinact = 0.004887 s⁻¹；KI = 5.34 μM

YS2：

• • IC₅₀（体外）：77 μM
• • 分辨率 1.27 Å 晶体结构（PDB: 9ZLM），RMSD = 0.41 Å
• • 延伸至 BTK "背口袋"（back pocket），与 Gatekeeper 和 C-helix 之间的空间相互作用

YS3：

• • IC₅₀（体外）：8.4 μM
• • AF3 预测与晶体结构存在偏差（约 1 个键旋转的差异），推测与多构象结合模式有关
• • 与 CC-292 的结合口袋相似，后者也已知具有多构象

5.3 YS1 的结合模式：全新口袋发现

晶体学揭示了 YS1 与 BTK 结合的独特模式：

YS1 并非传统的 front-pocket 或 back-pocket 结合剂，而是从 P-loop（甘氨酸富集环）下方伸入，将其氯代苯基延伸至由以下残基围成的全新亚口袋：

• • M437（靠近 N-lobe 的 C-helix 附近）
• • L542 / Y545 / V546（激活环 N 端）

这一结合模式伴随：

• • P-loop 向开放构象重排（accommodating the ligand）
• • F413 侧链采取异常朝向（指向 ATP 结合口袋而非激活环）
• • Y551 未进入"被隔离状态（sequestered state）"，与 front-pocket 抑制剂不同

意义：YS1 的发现拓展了我们对 BTK 可成药口袋的认知，揭示了一个此前未被利用的新亚口袋，为克服 BTK 抑制剂耐药性提供了新的结构基础。

5.4 晶体结构验证 AF3 预测精度

YS1 AF3 预测还正确判断了环己基的反式（trans）异构体构型。

六、深度讨论

6.1 AF3 何以优于传统对接？

结构原因分析：

1. 1. 共价键位点指定：明确指定共价键位点可将 AF3 的结合口袋预测准确率从 81% 提升至 93%（原 AF3 论文数据）
2. 2. 蛋白骨架柔性：AF3 可采样蛋白骨架构象空间，处理 induced-fit 效应。相比之下，传统对接使用固定骨架——当 DOCKovalent 用相同库对 BTK 进行静态结构对接时，YS1 仅排在第 15 百分位（AF3 mPAE 方法排在前 0.05%），且对接构象与晶体结构不符（F413 侧链产生碰撞）
3. 3. 隐蔽口袋采样：AF3 暴露了 YS1 结合的 P-loop 下方新亚口袋
4. 4. E2E 学习的隐性物理知识：Rosetta 重打分 AF3 模型即可优于传统对接，表明 AF3 生成的结构具有足够的物理合理性

6.2 mPAE 的本质与局限

为何 mPAE 有效但 mPAE 与亲和力无关？

这是本文一个深刻且反直觉的发现：mPAE 与结合亲和力（如 IC₅₀、Kd）无显著相关性（Pearson r = 无显著相关），但它能有效区分活性/非活性分子。

作者的解释：mPAE 是一个"粗粒度（coarse-grained）"的分类指标，本质上反映的是配体是否能在预测结合口袋中形成稳定的、几何合理的结合模式，而非结合自由能的精确量化。这与 Masters et al.（2025）的研究结论一致：AF3 等共折叠模型并不依赖精确的物理相互作用来放置配体，而是基于训练集中的统计模式。

选择性预测的局限：
交叉对接实验（cross-docking）显示，对于位点相近的激酶（如 BTK、BMX、ITK 等均含有 Cys 在同源位置），mPAE 无法有效区分。因此 mPAE 目前不适用于激酶选择性预测。

6.3 实用性的瓶颈与解决方案

速度瓶颈：每个配体约需 266 秒（不含蛋白 MSA 生成的 ~22 分钟），对数十亿量级的超大型虚拟库筛选不可行。

建议的级联筛选策略：

超大型虚拟库（10⁹ 量级）
        ↓ 快速传统对接（毫秒/分子）
前 10⁶ 候选
        ↓ AF3 + mPAE 精筛（~266 s/分子）
最终候选（~0.05%）
        ↓ 实验合成与验证

弹头多样性限制：本研究仅针对丙烯酰胺弹头（靶向 Cys），无法处理多弹头库中不同亲电试剂反应活性差异的问题。扩展至其他弹头类型（靶向 Ser、Lys、Tyr、His）和其他亲核残基是重要的未来方向。

6.4 AF3 的物理局限性

若干研究表明 AF3 存在物理建模的缺陷：

• • YS3 的错误预测：将疏水基团朝向溶剂，可能反映 AF3 对疏水效应（hydrophobic effect）建模不足（与 Childs et al. 2025 一致）
• • 共价键几何畸变：AF3 共价共折叠倾向于产生键长/键角几何不合理的共价键，但整体配体姿态仍然准确（结构"补偿"）
• • 不依赖精确物理相互作用：Masters et al.（2025）的对抗性实验（adversarial experiments）表明，AF3 对结合位点局部突变不敏感

这些局限性提示：将 AF3 的统计学习与物理化学知识（如 Rosetta 能量函数、力场）结合，是未来改进共折叠方法的重要方向。

七、与相关工作的比较

八、方法学要点（对实践者的启示）

8.1 如何复现/应用本方法

1. 1. 蛋白输入：仅需氨基酸序列（无需晶体结构），AF3 服务器免费可用（alphafoldserver.com）
2. 2. 配体输入：SMILES → 三维构象生成（如 RDKit、OMEGA）→ 指定共价键原子对
3. 3. 关键参数：
• • mPAE 阈值建议：< 0.9 Å（约 0.05% 命中率，可按需调整）
• • 相似性过滤：Tc < 0.35（Morgan 指纹）排除与已知抑制剂相似的化合物
4. 4. 计算资源：MSA 生成约需 22 min/蛋白（20 CPU），AF3 推理约 266 s/配体（GPU，型号依赖）

8.2 注意事项

• • 对于已有大量已知抑制剂的靶点（如 BTK），需严格进行新颖性过滤（novelty filter），避免重发现已知骨架
• • mPAE 在同源位点的激酶之间分辨率有限，选择性评估仍需体外实验
• • YS3 案例提醒：对 AF3 预测构象存疑时，应进行晶体学验证，不能完全信赖预测结合模式
• • 对于共价键几何（键长/键角），AF3 预测可能偏差较大，需结合化学合理性判断

九、总结与展望

核心结论

本文通过以下五点系统性地证明 AF3 可以实际用于共价药物发现：

1. 1. ✅ 构建了 COValid，填补了共价 VS 基准数据集的空白
2. 2. ✅ 证明 AF3 mPAE 指标在所有测试靶点均大幅优于传统共价对接工具
3. 3. ✅ 证明其优越性不依赖训练数据泄露（消融实验）
4. 4. ✅ 在非共价 VS（DUDE-Z）上同样优于传统方法
5. 5. ✅ 前瞻性发现了全新骨架的 BTK 共价抑制剂 YS1，并通过晶体学验证了 AF3 预测的亚埃精度

对领域的影响

• • 方法论层面：为 AI 辅助共价药物发现提供了经过充分验证的工作流程
• • 药物发现层面：开启了利用蛋白构象柔性进行大规模虚拟筛选的新时代，对传统对接难以处理的柔性靶点尤为重要
• • 生物学层面：YS1 揭示了 BTK 的全新结合亚口袋，为克服 BTK 抑制剂耐药性提供新思路

未来方向

• • 扩展至非激酶靶点的系统性验证
• • 开发针对 Ser、Lys、Tyr、His 等其他亲核残基的弹头，配合 AF3 共折叠
• • 融合物理化学能量函数改善 AF3 对疏水效应的建模
• • 建立 AF3 + 快速对接的级联筛选流程，适配十亿量级超大型虚拟库
• • 探索 AF3 建模共价反应中间态（prereaction state）的可行性，以更好捕捉 kinact 相关信息