Nat. Biotechnol. | 机器学习设计受体: 构建人工变构蛋白开关的新范式

蛋白质变构调控是生命体系中信息传递与能量转换的核心机制，而构建人工变构蛋白一直是合成生物学的重要目标。研究人员发现，由机器学习设计的最小配体结合结构域，即使不发生整体构象变化，也可以作为高效受体构建单组分变构蛋白开关。这些开关能够形成比色、发光和电化学信号输出的生物传感器，可用于检测小分子、多肽及蛋白，并可进一步组装为分子内的YES与AND逻辑门。

进一步地，研究人员构建了完全由人工受体和人工报告模块组成的变构蛋白系统。氢氘交换质谱与¹⁹F核磁分析表明，配体结合会降低体系的构象熵，从而提升报告模块的催化活性。该策略的应用潜力通过两个实例得到验证：一是构建对类固醇依赖的抗生素抗性大肠杆菌，二是开发能够定量检测类固醇激素的生物电子器件。

几乎所有生物体内的实时信息处理都依赖由蛋白开关构成的网络，而这些网络的核心机制是变构调控，即局部输入在远端产生功能响应。因此，设计具有可控输入与输出的人工变构蛋白，是蛋白工程与合成生物学的关键目标。

传统策略通常依赖于将配体结合结构域插入荧光蛋白或酶中，并要求该结构域在结合配体时发生明显的整体构象变化。然而，这类天然结构域资源有限，成为蛋白开关设计的瓶颈。

另一方面，理论研究早已指出，变构调控并不一定依赖大尺度构象变化，而可以通过蛋白内部的动态波动与构象熵变化实现。但这一机制在人工蛋白设计中的潜力尚未被充分探索。

在这一背景下，研究人员提出一个关键问题：是否可以利用机器学习设计的、几乎不发生构象变化的人工结合结构域来构建高效变构开关？

研究人员首先筛选不发生显著构象变化的天然配体结合结构域，并将其通过“环状重排（circular permutation）”方式嵌入β-内酰胺酶中，构建初代蛋白开关。随后，进一步引入机器学习设计的人工结合蛋白（包括类固醇、小肽和蛋白结合体），构建突变库并筛选具有配体响应能力的嵌合体。

在此基础上，通过改变插入位点、组合多个受体、替换不同报告酶（包括发光酶与氧化还原酶），系统评估变构开关的可扩展性。同时，利用¹⁹F-NMR、HDX-MS以及分子动力学模拟分析其作用机制，并通过细胞实验与电极构建验证其应用潜力。

研究人员首先选择一个在结合配体时仅发生局部环区变化的抗卡林蛋白，并将其通过环状重排嵌入β-内酰胺酶中。所得嵌合蛋白能够对秋水仙碱产生剂量依赖响应，证明即使没有整体构象变化，也可以实现功能耦联。

这一结果首次表明，整体构象变化并不是构建变构蛋白的必要条件。

图1：变构开关设计与活性响应。

为排除天然蛋白中潜在的隐藏构象变化影响，研究人员进一步使用机器学习设计的类固醇结合蛋白作为受体。

结果显示，这些人工设计蛋白在嵌入β-内酰胺酶后，能够形成高效的变构开关，其中最佳系统动态范围接近400倍。与此同时，环状重排被证明是变构产生的关键步骤，因为未重排结构无法实现配体依赖调控。

此外，该策略还扩展至多肽与蛋白配体，证明其具有广泛适用性。

研究人员进一步探索结构设计空间，发现不同构建体在亲和力、响应速度和动态范围之间存在热力学耦合关系。

通过在同一蛋白中引入两个受体，可以构建分子内YES逻辑门，显著提高动态范围；而通过组合不同特异性的受体，则可以实现AND逻辑门，仅在两个配体同时存在时激活。

这一结果表明，蛋白变构开关可以像电子元件一样进行逻辑组合。

图2：YES/AND逻辑门与多报告系统。

研究人员将人工受体与不同类型报告蛋白进行组合，包括葡萄糖脱氢酶、NanoLuc荧光素酶以及完全由AI设计的LuxSit Pro。

实验表明，这些人工受体具有高度模块化特性，可以在不同报告系统中保持功能。同时，完全人工构建的变构系统也能够正常工作，尽管动态范围相对较小。

进一步通过引入双受体设计，性能再次得到提升，说明该策略具有良好的可扩展性。

研究人员通过多种生物物理手段深入解析机制。

首先，加入变性剂并未促进活性恢复，说明该系统并非通过“折叠/解折叠”机制工作。其次，CD光谱显示配体结合几乎不改变二级结构。

然而，¹⁹F-NMR与HDX-MS结果揭示，配体结合显著改变局部结构动态，尤其是在连接受体与报告模块的区域。这些变化表明，信号可以从结合位点传播至远端催化中心。

综合分析表明：

环状重排增加构象熵 → 抑制酶活 → 配体结合降低熵 → 激活酶功能

图3：NMR与HDX-MS揭示的变构机制。

研究发现，环状重排会降低受体对配体的亲和力，这是由于构象熵增加所导致。

为此，研究人员引入额外的辅助结合结构域，通过局部浓度提升与协同作用，显著提高整体亲和力，实现约7倍增强。

这一策略提供了一种补偿熵惩罚的通用设计原则。

图4：双结合域提升亲和力。

在细胞层面，研究人员构建了表达变构β-内酰胺酶的大肠杆菌，使其抗生素抗性依赖于类固醇存在，实现“配体依赖生长”。

在器件层面，将蛋白开关固定在电极表面后，可以通过电流变化定量检测类固醇浓度，并支持多次循环检测。

这些结果表明，该系统具有实际应用潜力。

图5：细胞与电化学生物传感器应用。

本研究展示了一种全新的蛋白变构设计范式，即利用机器学习设计的稳定小型结合蛋白，通过环状重排引入构象熵调控，从而实现功能耦联。

与传统依赖构象变化的设计策略不同，该方法利用的是蛋白内部动态与熵变化，使得可用受体空间大幅扩展。

尽管当前系统在亲和力与动态范围之间仍存在权衡，但通过逻辑门组合、辅助结合域以及机器学习优化，可以有效提升性能。

此外，小尺寸人工结合蛋白显著降低了设计复杂度，使得高通量筛选成为可能。这一策略为构建复杂生物计算电路、实时诊断系统以及生物电子器件提供了新的技术路径。

总体来看，研究人员提出的框架不仅拓展了变构调控的理论认知，也为人工蛋白系统设计提供了可编程、模块化的新方向。

Guo, Z., Smutok, O., Lee, G.R. et al. Artificial allosteric protein switches with machine-learning-designed receptors. Nat Biotechnol (2026). 

https://doi.org/10.1038/s41587-026-03081-9