整合素连接激酶（ILK）是一种位于黏着斑的无催化活性伪激酶，在其中作为关键支架蛋白，调控整合素信号传导与肌动蛋白细胞骨架结构，与癌症、慢性肾病密切相关。

然而，目前报道的小分子配体都没有能用生物物理方法证明过它们真的结合了ILK。它们很可能只是在ILK的下游发挥作用，所报道的细胞效应来源于通路内间接机制，而非直接的靶向活性。因此，开发一个能够直接结合ILK的小分子配体，并对其进行全面充分的验证具有重要意义。

ILK及其关键的细胞相互作用蛋白

5月25日，法兰克福歌德大学Stefan Knapp课题组在Journal of Medicinal Chemistry上发表研究，报道了首个经生物物理方法严格验证的ILK直接结合配体。通过高分辨率共晶结构，直接“看见”了配体与ILK的结合模式，为相关靶向药物的开发奠定了分子基础。

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首个真实结合ILK的分子

研究团队以 ILK:αparvin 复合物为靶点，利用DSF对含约380个激酶抑制剂的化合物库进行筛选，成功锁定Pelitinib为最优苗头分子。

高通量筛选的DSF筛选结果

进一步通过表面等离子共振（SPR） 测定，Pelitinib 与 ILK:αparvin 复合物呈现高亲和力结合，KD = 221 nM。为排除其丙烯酰胺弹头可能带来的共价结合干扰，研究者对其进行温和还原，进一步合成了DHP，SPR结果显示，DHP 保持高亲和力（KD=252 nM），且激酶选择性较 Pelitinib 显著提升。

同时，文章利用DSF和SPR技术对此前文献报道的Cpd 22、EN300进行验证发现，这些ILK“抑制剂”没有直接和ILK:α-parvin复合物结合，其既往报道的细胞效应很可能源于脱靶效应或下游通路干扰。

化合物1（DHP）的合成及亲和力测定

这也说明在药物发现的早期阶段，仅凭细胞活性筛选极易出现假阳性的问题，生物物理方法才是确证靶向结合的金标准。其中，SPR和DSF等技术回答“是否结合”的问题，而共晶结构则进一步回答“如何结合”的问题。

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共晶结构看清ILK配体结合模式

研究者进一步解析了ILK:α-parvin与DHP的共晶结构。电子密度图清晰显示，DHP以Type-I模式结合于ATP口袋；喹啉氮与铰链区的M272形成主链氢键；3-氰基与S336形成额外的氢键稳定作用。

共晶结构揭示ILK配体结合模式

这个结构直接解释了为什么临床上成功的EGFR抑制剂Afatinib无法结合ILK。尽管Afatinib与Pelitinib结构相似，但Afatinib是喹唑啉骨架且缺乏3-氰基，同时在7-位有一个四氢呋喃环而非乙氧基。这些差异共同导致了其无法结合ILK。结构叠加显示，ILK铰链区GK+2位置为体积较大的色氨酸（W271），而EGFR对应位置是较小的亮氨酸（L791），Afatinib的四氢呋喃环恰好与ILK的W271发生空间位阻。研究者进一步通过W271L 突变实验直接验证了该位点的决定性作用。共晶结构信息直接指导了后续的构效关系研究，避免了大量低效合成探索。

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从结构到功能的闭环验证

研究最后通过NanoBRET技术在经透化处理的细胞中验证了Pelitinib、DHP和含哌嗪衍生物的靶点占据率，IC50与SPR数据高度一致。细胞成像进一步显示，DHP可剂量依赖性重塑肌动蛋白骨架。                          

细胞水平靶点占据验证与肌动蛋白骨架调控

 

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▶ 高精度晶体结构解析：原子级分辨率揭示靶点-配体相互作用；

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▶ 体外靶点验证：DSF、SPR 等技术确证靶向结合。

 

文献信息：

期刊：Journal of Medicinal Chemistry

标题：Identification and Validation of 3-Cyano-Quinoline Ligands Targeting Integrin-Linked Kinase (ILK)

DOI: 10.1021/acs.jmedchem.5c03773

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