从头设计能够识别药物小分子的蛋白质，可用于药物递送、生物传感和人工酶开发。然而，与蛋白-蛋白相互作用相比，小分子结合蛋白的设计需要同时优化蛋白序列、三维骨架、侧链构象以及配体姿态，长期以来高度依赖大规模实验筛选。

2026年6月，哈佛大学与Dana-Farber癌症研究所研究团队在《Nature》发表题为“Zero-shot design of drug-binding proteins via neural iterative selection−expansion”的论文，提出NISE设计框架。研究人员分别为抗肿瘤药物依喜替康和抗凝药物阿哌沙班设计结合蛋白，实验成功率达到100%和83%。最佳阿哌沙班结合蛋白的解离常数低至80pM；针对依喜替康的最佳设计经两处计算机建议的突变后，亲和力提高100倍，并能连续数天保护药物不发生水解。

小分子结合蛋白为什么难以设计？

蛋白结合能力来自多个因素的共同作用：蛋白必须正确折叠，结合口袋需要与小分子的形状互补，极性基团需要形成适当的氢键，而疏水表面还要实现紧密堆积。小分子本身也具有可旋转化学键和多种构象。改变一个氨基酸，可能同时影响局部侧链、蛋白骨架和配体姿态。因此，只固定蛋白骨架后进行一次序列设计，往往无法找到真正协调的结合方案。

过去效果较好的方法通常需要高通量实验筛选。少数实现较高计算命中率的研究，也常将配体官能团近似为氨基酸片段，适用范围有限。研究团队提出，应将设计质量定义为一种三方“自洽性”：给定蛋白骨架和配体位置后设计出的序列，能否被结构模型重新预测为接近原始设计的蛋白-配体复合物。

NISE：让两个神经网络闭环协作

NISE全称为Neural Iterative Selection–Expansion。其核心由两个方向相反的神经网络组成。第一个模型LASErMPNN根据蛋白骨架和配体构象设计氨基酸序列。它是一种配体感知图神经网络，不仅预测蛋白序列，还会同步预测结合位点的侧链旋转异构体。第二个模型则从设计序列和配体身份出发，重新预测蛋白-配体复合物的三维结构。研究分别使用了RoseTTAFold-All Atom和Boltz-2。每轮迭代中，NISE先生成大量序列，再预测其复合物结构，并选择蛋白骨架、配体位置和模型置信度更自洽的设计进入下一轮。入选结果随后被扩展为新的序列与结构群体，继续重复这一过程。

图1 NISE的自洽性优化原理与迭代流程。模型在“由结构和配体设计序列”与“由序列预测复合物结构”之间反复循环，逐渐优化蛋白序列、骨架和配体构象。

研究发现，神经网络驱动的循环可以同时改善蛋白和配体的结构自洽性。相比之下，将复合物结构预测模型替换为传统能量函数后，设计指标并未随迭代稳定改善。


从概率角度看，两个网络分别学习“给定结构和配体时序列应当是什么”以及“给定序列时复合物结构应当是什么”。交替采样相当于在序列、结构和配体的联合分布中不断寻找更合理的区域。

LASErMPNN能否理解真实结合位点？

研究团队首先检验LASErMPNN是否能够恢复天然蛋白-配体复合物中的序列。在独立测试集中，模型对结合位点氨基酸的平均恢复率约为53%，明显高于不提供配体信息时的38%。它还能够同时预测与配体接触的侧链构象。

研究人员进一步采用严格的数据隔离策略，从训练集中排除链霉亲和素及相关蛋白。面对未见过的生物素结合结构，LASErMPNN仍能恢复大量核心和结合位点残基，并生成能够被结构模型正确折叠的序列。

团队还测试了一个已有的从头设计胆红素结合蛋白PiB。在完全排除PiB训练信息后，模型设计出的最高排名序列仍恢复了74%的结合位点残基，为后续零样本设计提供了依据。

为exatecan设计保护性结合蛋白

依喜替康（exatecan）是一种高效拓扑异构酶I抑制剂，也是多种抗体偶联药物所使用载荷的结构基础。它的活性依赖一个容易水解的内酯环；内酯环打开后，药物活性会明显下降。研究人员希望设计一种蛋白，不仅能够结合依喜替康，还能包埋并保护其内酯环。团队首先构建四螺旋束骨架，使用传统COMBS与Rosetta方法生成初始结合位点，再去除原有序列，将骨架和配体坐标交给NISE联合优化。NISE显著重塑了初始结构：靠近配体的一段非规则螺旋变得更加标准，两条螺旋之间的空间收窄，依喜替康被拉入更深的口袋，蛋白与配体的疏水接触面积随之增加。

图2 依喜替康结合蛋白的设计和实验验证。NISE在传统初始结构基础上共同调整蛋白骨架、序列及药物构象，并获得高亲和力设计EPIC。

研究人员最终选择4个NISE设计进行实验，4个全部能够结合依喜替康，成功率达到100%；其中3个解离常数低于10 µM。亲和力最高的蛋白被命名为EPIC，其解离常数为120 nM。相比之下，传统方法得到的最佳设计解离常数为8 µM，约弱67倍；人血清白蛋白与依喜替康的解离常数为43 µM。

EPIC还表现出明确的分子选择性。它与结构相近的FL118、贝洛替康和喜树碱的解离常数分别为6、19和90 µM，对伊立替康以及其他类别药物几乎没有可检测结合。这说明蛋白识别的并非宽泛疏水特征，而是依喜替康特定取代基组合。

不做实验筛选，再将亲和力提高100倍

获得EPIC后，研究团队没有使用实验突变扫描或高通量筛选，而是让LASErMPNN重新“校对”结合位点。模型建议将第51位谷氨酰胺替换为天冬酰胺，并将第97位甲硫氨酸替换为亮氨酸。两种单点突变分别将解离常数降至8.0 nM和7.4 nM，均带来超过10倍的亲和力提升。将两个突变组合后，EPIC(Q51N/M97L)的解离常数进一步降至1.2 nM，相比原始EPIC提高100倍。作为反向验证，模型预测不利的G104M突变使亲和力下降至57 µM。

图3 LASErMPNN对EPIC进行神经校对。Q51N和M97L单点突变均显著增强结合，双突变体的解离常数达到1.2 nM；晶体结构验证了计算模型的结合模式。

研究团队随后解析了EPIC和EPIC(Q51N)与依喜替康复合物的晶体结构，分辨率分别为2.0 Å和2.2 Å。实际蛋白骨架、关键侧链和药物位置与计算设计高度一致。Q51N缩短了侧链，使依喜替康向口袋内部移动约0.5 Å，并形成更理想的氢键网络。这说明神经网络提出的突变并非偶然命中，而是基于合理的结构调整。

结合蛋白让依喜替康保持闭环状态

在生理条件下，依喜替康的活性内酯环会迅速水解，并在约10小时内下降到15%左右的平衡比例。血浆中的高浓度白蛋白还能推动药物向低活性的开环形式转变。EPIC采取了相反的策略：它将药物内酯环埋入结合口袋，隔绝水分子接近，从而稳定药物的闭环形式。

图4 EPIC对依喜替康内酯环的保护作用。游离药物及白蛋白结合药物会逐渐水解，而EPIC通过包埋内酯环维持药物的闭环活性形式。

时间分辨吸收光谱显示，与双突变EPIC结合后，超过99%的依喜替康在至少50小时内保持结合状态，实验期间未观察到明显水解产物。即使加入接近生理浓度的500 µM人血清白蛋白，这种保护作用仍然存在。这使EPIC不仅是一种“能结合药物的蛋白”，还具备潜在功能：保存不稳定药物的活性形式，并作为后续递送或靶向释放系统的基础组件。

更严格的测试：apixaban结合蛋白

为了判断NISE是否依赖四螺旋束或特定药物，研究人员又选择了化学结构不同的抗凝药阿哌沙班（apixaban），并改用混合α/β结构的NTF2蛋白骨架。这项任务还可以与既往方法直接比较。此前研究使用相同类型的骨架设计阿哌沙班结合蛋白，需要实验测试9,024个设计，最终得到4个结合蛋白，最佳解离常数为680 nM。

本研究从50个由Boltz-2评估的NTF2骨架出发，将阿哌沙班刚性对接到不同位置，再使用LASErMPNN和Boltz-2进行NISE迭代。最终仅选择6个序列开展实验。其中5个能够结合阿哌沙班，成功率达到83%，且解离常数均低于50 nM。最佳设计被命名为APEX，其与阿哌沙班的解离常数达到80 pM，95%置信区间为40-140 pM。

图5 NISE利用NTF2骨架设计阿哌沙班结合蛋白。6个实验设计中有5个实现结合，最佳设计APEX的解离常数达到80 pM。

APEX比既往最佳计算设计的亲和力提高约8,500倍，接近论文所概括的“近10,000倍”。它不结合依喜替康，表明设计口袋具有明确的药物选择性。更重要的是，NISE在依喜替康和阿哌沙班任务中使用了不同的蛋白折叠、不同的配体对接方法和不同的复合物预测模型，说明该框架不局限于某一种骨架或神经网络。

局限性

NISE仍然需要预先准备合适的蛋白骨架和初始配体位置。目前的初始姿态来自COMBS、刚性对接或预先计算的骨架库，因此它还不是完全从空白空间自动生成蛋白。模型主要进行正向设计，即优化目标药物的结合。EPIC和APEX虽然表现出较好选择性，但对于结构高度相似的脱靶分子，未来仍需引入更系统的负向设计。此外，本研究只验证了两种药物。80 pM的APEX极具亮点，但是否能够在更广泛的化学类别、柔性配体和复杂生理环境中保持高成功率，还需要更多实验检验。

总结

NISE将序列设计和蛋白-配体结构预测连接成闭环，使蛋白序列、三维骨架与配体构象在迭代中共同优化。针对依喜替康，4个设计全部实现结合，最佳初始设计EPIC达到120 nM，并通过两处计算预测突变将亲和力提高至1.2 nM。优化后的蛋白还能保护药物内酯环数天不发生明显水解。针对阿哌沙班，6个设计中有5个成功，最佳设计APEX达到80 pM，较既往计算设计提高近4个数量级。这项工作表明，小分子结合蛋白设计正在从“生成数千个候选物并依赖实验筛选”，迈向“计算设计少量序列并直接获得高亲和力结果”。如果这种成功率能够扩展到更多药物，定制化药物载体、传感器和人工酶的设计周期可能被显著缩短。

论文链接：

https://doi.org/10.1038/s41586-026-10670-w

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