Nat. Commun. | 融入AI优化锌指蛋白提升微型碱基编辑器的编辑效率与靶向范围

碱基编辑技术能够在不产生DNA双链断裂的情况下实现单碱基精准编辑，因此已成为治疗遗传疾病的重要工具。然而，目前应用最广泛的碱基编辑器通常基于SpCas9构建，整体体积较大，难以装载进入单个腺相关病毒（AAV）载体进行体内递送。近年来虽然出现了Cas12f、IscB等超小型CRISPR蛋白，并成功开发出对应的微型碱基编辑器，但这些系统普遍存在编辑效率较低、PAM限制严格以及可编辑位点有限等问题，严重制约了其临床应用。

研究人员提出了一种全新的锌指蛋白增强微型碱基编辑器（ZFP-enhanced miniature base editor，zmBE）。该策略将可编程锌指蛋白与微型碱基编辑器融合，通过增加目标DNA结合能力，提高编辑效率并扩大靶向范围。与此同时，研究团队进一步引入蛋白质语言模型（Protein Language Model，PLM）辅助优化锌指蛋白设计，使高性能zmBE能够快速构建，而无需大量实验筛选。

基于这一设计，研究人员成功开发出可利用单个AAV递送的微型碱基编辑器，实现SMN2基因关键位点的高效编辑，恢复SMN2外显子7正常剪接，并在脊髓性肌萎缩症（SMA）小鼠模型中改善疾病表型。该研究建立了一种通用的平台，可广泛提升各种微型碱基编辑器的性能，为未来体内基因治疗提供了新的技术路线。

近年来，CRISPR衍生碱基编辑器已经成为精准基因治疗的重要工具。与传统CRISPR/Cas9依赖DNA双链断裂不同，碱基编辑器能够直接完成A→G或C→T等单碱基替换，因此具有更高安全性，在遗传病修复、基因失活以及RNA剪接调控等领域表现出巨大潜力。

目前，大多数成熟碱基编辑器均建立在SpCas9基础之上，其蛋白体积接近或超过AAV载体约4.7 kb的包装极限。当同时加入sgRNA表达框后，很难利用单个AAV完成递送，因此通常需要采用双AAV系统。这不仅降低递送效率，也增加生产成本，并可能导致两种病毒不能同时进入同一细胞，从而影响治疗效果。

近年来不断发现的新型超小型CRISPR系统，如Cas12f、TnpB以及IscB，大大缩小了编辑器尺寸，使单AAV递送重新成为可能。然而，小型化也带来了新的问题。首先，微型编辑器对DNA结合能力较弱，因此编辑效率明显下降；其次，其识别PAM序列更加严格，许多致病突变无法被覆盖；此外，如何在保证高效率的同时维持较高编辑特异性，也是当前研究的重要挑战。

另一方面，锌指蛋白（Zinc Finger Protein，ZFP）是一类高度模块化的DNA识别蛋白，每个锌指结构能够识别三个碱基，因此理论上可以组合识别几乎任意DNA序列。过去锌指蛋白已经广泛应用于基因编辑和转录调控，但由于自身无法有效打开双链DNA，因此直接构建碱基编辑器时效率有限。

研究人员提出，如果利用锌指蛋白作为辅助DNA结合模块，与微型CRISPR编辑器融合，或许能够稳定DNA结合过程，提高R-loop形成效率，从而增强整个编辑系统性能。同时，随着人工智能的发展，蛋白质语言模型已经能够预测蛋白突变对功能的影响，因此还有望进一步帮助设计性能更优的锌指蛋白，降低传统人工筛选成本。

研究人员首先以Un1Cas12f1来源的微型腺嘌呤碱基编辑器作为模型，在不同位置融合可编程锌指蛋白，系统比较各种融合方式对编辑效率的影响。随后，他们进一步优化锌指蛋白与编辑器之间的位置关系、连接距离以及锌指数量，并分析其对编辑窗口、PAM识别范围以及脱靶效应的影响。

在获得最佳设计方案后，研究人员将这一策略进一步推广至IscB来源的腺嘌呤和胞嘧啶碱基编辑器，以验证其通用性。同时，他们引入蛋白质语言模型ESM2和SaProt，对人工模块化设计得到的锌指蛋白进行智能优化，通过预测有利突变提高DNA结合能力，并最终构建性能更优的zmBE。最后，研究人员将优化后的编辑器封装进入单个AAV，在脊髓性肌萎缩症小鼠中验证其体内治疗效果。

研究人员首先分析了微型Cas12f编辑器编辑效率偏低的原因。他们认为，相较于SpCas9，Cas12f对DNA结合能力较弱，难以稳定形成R-loop结构，因此限制了脱氨酶发挥作用。

基于这一假设，他们分别尝试将锌指蛋白和TALE融合至Cas12f编辑器不同位置，并比较各种构型的编辑效果。

实验发现，无论在PLXNB2位点还是TRAC位点，融合锌指蛋白均可大幅提高编辑效率。在部分位点，编辑效率提高超过15倍，而在另一些位点甚至接近100倍。相比之下，虽然TALE也能够提高编辑效率，但整体提升幅度明显低于锌指蛋白。

进一步比较六种不同融合方式后，研究人员发现，将TadA-TadA8e置于Cas12f前端，而锌指蛋白连接于Cas12f C端，是整体性能最佳的设计。这种构型在多个内源基因位点平均可提高三十倍以上编辑效率，在神经细胞中同样表现出明显优势。

值得注意的是，引入锌指蛋白后，并没有明显增加Indel发生率，也没有改变编辑窗口位置，说明编辑效率的提升主要来自DNA结合能力增强，而非引入新的编辑机制。

随后，研究人员继续优化锌指蛋白设计参数，包括识别序列位于靶序列上下游的位置、DNA两者之间间隔距离以及锌指数量等。实验结果表明，只要锌指识别位点距离编辑区域约1–25 bp，都能保持良好的增强效果；三个锌指组成、识别约9 bp DNA即可获得较理想性能。这意味着，对于绝大多数目标位点，都可以较容易设计出适配的锌指蛋白，提高微型编辑器活性。

图1: 锌指蛋白融合显著增强Cas12f来源微型碱基编辑器活性。

除了提升编辑效率外，研究人员进一步关注锌指蛋白是否能够突破Cas12f严格的PAM限制。

天然Cas12f主要识别TTTR型PAM，因此大量潜在治疗位点无法编辑。研究人员首先构建一系列不同PAM序列的报告系统进行测试。

实验结果显示，当PAM改变为TTTT、CTTR、GTTR或ATTR后，原始Cas12f编辑器几乎完全失去活性；然而融合锌指蛋白后，大部分这些非经典PAM均重新获得较高编辑能力，部分甚至恢复到接近天然TTTR PAM水平。

随后，在多个真实基因位点中也观察到了类似结果。例如，在携带ATTA PAM的Pcsk9位点，原始编辑器几乎无法编辑，而融合锌指蛋白后编辑效率提高超过140倍，使原本无法编辑的位点变得可编辑。

进一步统计ClinVar数据库中已知致病突变发现，原始Cas12f编辑器只能覆盖约1500个可治疗突变，而采用zmBE策略后，可覆盖位点增加至约5700个，可治疗遗传突变数量提升约3.8倍。

这一结果说明，锌指蛋白不仅提高了DNA结合稳定性，同时降低了Cas12f对PAM序列的依赖，大幅扩大了微型碱基编辑器的适用范围，为更多遗传疾病提供了治疗可能。

图2: 锌指蛋白融合显著扩大Cas12f微型碱基编辑器PAM识别范围，提高可编辑遗传突变数量。

提高编辑效率通常伴随着脱靶增加，因此研究人员进一步系统评估了zmBE的安全性，包括RNA脱靶、DNA脱靶以及锌指蛋白自身可能带来的额外风险。

首先，他们利用RNA测序分析全转录组RNA编辑情况。此前已有研究表明，多种腺嘌呤碱基编辑器会产生大量A→I型RNA脱靶编辑，Cas12f来源编辑器同样存在这一问题。然而，当融合锌指蛋白后，RNA脱靶数量明显下降，总体A→I编辑事件减少约三分之二，说明ZFP不仅没有增加RNA副作用，反而改善了编辑器特异性。

随后，研究人员检测多个预测DNA脱靶位点。结果发现，在绝大多数基因位点，zmBE虽然显著提高了目标位点编辑效率，但预测脱靶位点几乎没有同步增加。即使个别位点出现轻微脱靶增强，其增长幅度远低于目标位点，因此整体脱靶/靶向编辑比值明显下降。这意味着编辑器真正获得的是更高的信噪比，而不是简单地增强整体活性。

研究人员进一步分析锌指蛋白是否会因为自身DNA结合能力而诱导新的编辑事件。实验显示，即使检测到极少数位点存在统计学差异，其编辑频率仍低于测序技术误差范围，没有生物学意义。这说明锌指蛋白单独结合DNA并不会启动碱基编辑，真正的编辑仍然依赖sgRNA介导形成R-loop，因此双重识别机制进一步保证了编辑精度。

随后，研究人员又比较了另一类常用增强策略——融合非特异性DNA结合蛋白Sso7d。虽然Sso7d同样能够提高Cas12f编辑效率，但同时明显增加了多个脱靶位点编辑，导致脱靶比例基本保持不变。而ZFP则不同，它主要增强目标DNA结合，却没有同步增强脱靶结合，因此整体特异性远优于Sso7d。这一结果说明，可编程DNA结合模块比非特异性DNA结合蛋白更加适合作为微型编辑器增强策略。

总体来看，zmBE不仅实现了更高编辑效率，同时维持甚至提高了编辑特异性，使其更符合未来临床应用对于安全性的要求。

图3: 锌指蛋白融合显著降低微型碱基编辑器RNA脱靶，并提高DNA编辑特异性。

为了验证这一策略是否具有普适性，研究人员将其进一步推广至近年来发展迅速的IscB来源微型碱基编辑器。

首先，他们在IscB来源胞嘧啶碱基编辑器（CBE）中加入锌指蛋白。在多个基因位点，胞嘧啶编辑效率普遍提高两倍左右，部分位点甚至提高十余倍。

随后，在IscB来源腺嘌呤编辑器（ABE）中也观察到类似结果。多个内源基因位点平均编辑效率提高约九倍，其中部分位点已达到传统SpCas9-ABE相近水平。这意味着，即使体积更小的IscB系统，也能够通过ZFP获得接近大型编辑器的性能。

更重要的是，IscB本身具有较严格的TAM识别限制。融合锌指蛋白后，多种原本不能识别的非经典TAM序列重新获得编辑能力，进一步扩大了可编辑基因组范围。

研究人员还测试了一种近年来开发的小型TadA来源胞嘧啶编辑器，同样发现多数位点编辑效率明显提高，而Indel水平并未增加。

相比之下，当他们尝试把锌指蛋白融合到传统SpCas9碱基编辑器时，结果却完全不同。在多个测试位点，大多数没有明显改善，个别甚至略有下降，仅有极少数位点获得有限提高。这说明SpCas9本身DNA结合能力已经足够强，因此ZFP几乎没有额外贡献；而微型CRISPR系统由于天然结合能力较弱，因此能够从ZFP辅助结合中获益最大。

这一结果说明，ZFP融合并非针对某一种编辑器，而是一种具有广泛适用性的增强平台，尤其适用于各种超小型CRISPR系统。

图4: 锌指蛋白融合普遍提高IscB来源微型碱基编辑器编辑效率，并扩大TAM识别范围。

虽然锌指蛋白能够显著提高编辑效率，但传统锌指设计依赖模块拼接和大量实验筛选，效率较低。

为了解决这一问题，研究人员引入近年来迅速发展的蛋白质语言模型，包括ESM2和SaProt，对人工设计的锌指蛋白进行智能优化。

他们首先选择一个编辑效率较低的四指锌指蛋白作为起点，将其输入蛋白语言模型。AI预测大量可能提高DNA结合能力的单点突变，再筛选得分最高的候选进行实验验证。

结果令人惊喜。约四分之三预测突变均能提高编辑效率，其中多个单点突变即可明显增强DNA结合能力。随后，研究人员进一步组合多个有益突变，并结合不同锌指骨架重新构建蛋白，最终获得性能进一步提升的新型ZFP，使整体编辑效率较原始设计提高接近三倍。

整个优化过程中，仅需测试几十个AI预测候选，而传统方法往往需要构建数百甚至上千种组合。这说明蛋白质语言模型能够显著降低实验成本，加速高性能锌指蛋白开发。

研究人员据此建立了一套标准流程：首先利用模块化设计快速获得初始ZFP，再借助蛋白语言模型预测功能增强突变，随后组合多个有利突变并优化蛋白骨架，即可快速构建高效zmBE。

这一AI辅助设计策略使锌指蛋白工程逐渐由经验驱动转向数据驱动，为未来各种DNA结合蛋白优化提供了新的范式。

图5: 蛋白质语言模型辅助优化锌指蛋白，加速高性能zmBE开发。

为了验证zmBE的治疗潜力，研究人员选择脊髓性肌萎缩症作为模型疾病。

SMA主要由于SMN1基因缺失导致，而人体仍保留高度相似的SMN2基因。遗憾的是，由于SMN2外显子7存在一个关键单碱基差异，大部分转录本发生错误剪接，不能产生足够功能蛋白。因此，只需纠正这一单碱基，就有望恢复SMN2功能。

研究人员据此设计针对SMN2的zmBE。原始Cas12f编辑器只能产生约4%的编辑效率，而加入锌指蛋白后，编辑效率迅速提升至约40%，且仅出现极少量旁观者编辑。

随后，他们再次利用蛋白语言模型优化锌指蛋白，并进一步优化sgRNA骨架，使编辑效率继续提高。

由于整个编辑系统尺寸足够小，研究人员成功将编辑器与sgRNA全部装载进单个AAV载体，随后采用脑脊液联合静脉注射方式递送至SMA小鼠体内。

治疗后，小鼠运动功能明显改善。在翻正反射实验中，接受治疗的小鼠恢复站立能力明显增强。与此同时，治疗组体重下降速度减缓，寿命也显著延长，中位生存时间由约21天提高至28天，最长存活达到65天，远超过未治疗组。

进一步检测脑组织和脊髓组织发现，SMN2关键位点均获得稳定编辑，其中部分动物编辑率超过40%。全基因组测序分析则显示，仅发现极少数单核苷酸变异，而且几乎全部位于非编码区，仅有一个同义突变，没有预测功能影响。

这些结果证明，利用单AAV递送zmBE能够实现有效、安全的体内碱基编辑，为未来遗传病治疗提供了重要验证。

图6: 基于单AAV递送的zmBE成功恢复SMN2剪接，并改善SMA小鼠疾病表型。

研究人员建立了一种全新的锌指蛋白增强微型碱基编辑平台（zmBE）。这一平台最大的创新之处，在于并没有重新改造Cas12f或IscB本身，而是引入一个独立、可编程的DNA结合模块，从根本上提高微型CRISPR系统形成稳定R-loop的能力，因此能够同时提升编辑效率、扩大PAM或TAM识别范围，并保持较高编辑特异性。

与近年来大量依赖蛋白工程改造Cas蛋白的方法相比，zmBE具有明显优势。一方面，它能够直接兼容已有和未来发现的各种微型CRISPR系统，无需针对每一种Cas重新优化；另一方面，由于锌指蛋白具有高度模块化特性，可以根据目标序列灵活设计，因此理论上适用于绝大多数治疗位点。此外，与Sso7d等非特异性DNA结合蛋白相比，锌指蛋白提供的是序列特异性辅助结合，因此在提高编辑效率的同时，并不会明显增加脱靶风险。

本研究另一个重要贡献是首次将蛋白质语言模型系统引入锌指蛋白工程。传统锌指设计一直存在效率低、成功率有限等问题，而AI预测能够快速识别潜在有利突变，大幅减少实验筛选工作量。未来随着更多针对锌指蛋白的深度学习模型不断发展，这一设计流程有望进一步自动化，成为下一代可编程DNA结合蛋白开发的重要工具。

研究人员还提出了zmBE发挥作用的可能机制。他们认为，微型CRISPR蛋白天然DNA结合能力较弱，形成R-loop需要跨越较高动力学障碍。锌指蛋白首先结合目标DNA，相当于将编辑器锚定在靶位附近，提高局部浓度和结合稳定性，使Cas12f或IscB更容易识别非经典PAM并完成后续脱氨反应。这一机制也解释了为何传统SpCas9编辑器几乎无法从锌指融合中获得收益，因为SpCas9本身已经具有足够强的DNA结合能力。

最后，研究人员指出，本研究虽然已经证明单AAV递送zmBE能够改善SMA小鼠疾病，但治疗效果仍有进一步提升空间。未来若结合更高效的递送系统、更加精准的锌指设计以及其他RNA剪接调控策略，有望进一步提高治疗效果，并推动微型碱基编辑器在更多遗传疾病中的临床应用。

总体而言，本研究提出的zmBE不仅解决了微型碱基编辑器长期存在的效率低和靶向范围受限问题，还建立了AI辅助蛋白设计与小型基因编辑工具相结合的新范式，为单AAV递送的体内精准基因治疗提供了具有广泛应用前景的技术平台。

Huang, Q., Yang, D., Zhou, X. et al. Incorporating AI-optimized zinc finger proteins enhances the efficiencies and targeting ranges of miniature base editors. Nat Commun (2026). 

https://doi.org/10.1038/s41467-026-75912-x