Nature | AI重新设计的起始序列与进化产物促进蛋白质进化

定向进化是获得高性能酶的重要方法，但天然蛋白通常稳定性有限，在不断积累突变获得新功能的过程中容易失去折叠能力和催化活性，从而限制进一步进化。研究人员提出一种将人工智能蛋白设计与连续定向进化相结合的新策略，利用ProteinMPNN首先重新设计天然蛋白序列，提高稳定性和可表达性，再以这些AI优化后的蛋白作为新的进化起点开展噬菌体辅助连续进化（PACE）。

研究人员以肉毒毒素（BoNT）蛋白酶为模型，重新设计多个不同亚型蛋白酶，并在人类细胞、细菌以及连续进化系统中进行系统验证。结果表明，AI重新设计后的蛋白不仅保持天然催化活性，还显著提高稳定性、可溶表达和耐受突变能力。进一步开展四轮平行连续进化发现，以AI设计蛋白作为起点获得的新型蛋白酶活性始终优于天然蛋白进化所得产物，并能够进入天然蛋白无法到达的高适应性序列空间。最终，研究人员成功获得一种能够高效、特异切割神经退行性疾病相关蛋白Ataxin-2的新型蛋白酶，其底物特异性较天然蛋白进化路线提高79倍以上。这项研究建立了AI辅助蛋白设计与实验定向进化相结合的新范式，为酶工程和蛋白质设计提供了新的思路。

定向进化已经成为蛋白质工程最成功的方法之一，通过不断产生随机突变并筛选，可以获得具有新功能或更高活性的蛋白。然而，这一过程始终受到天然蛋白自身稳定性的限制。大多数天然酶本身仅具有有限的热稳定性，当不断积累有利于新功能的突变时，往往同时失去折叠稳定性或表达能力，使后续进化提前终止。

过去，为了解决这一问题，研究人员通常先进行稳定性进化，再开展功能进化，但这种方法不仅耗时，而且实验成本较高。近年来，人工智能蛋白设计迅速发展，ProteinMPNN等模型已经能够根据蛋白三维结构重新设计氨基酸序列，在保持天然结构的同时提高稳定性。然而，一个关键问题尚未解决：AI重新设计后的蛋白是否能够作为更好的定向进化起点，从而获得比天然蛋白更优的最终进化结果。

为回答这一问题，研究人员选择肉毒毒素蛋白酶作为研究对象，系统比较天然蛋白和AI重新设计蛋白在连续进化中的表现，希望揭示AI设计如何改变蛋白质进化路径，并探索人工智能与实验进化相结合的新策略。

研究人员首先利用ProteinMPNN对BoNT/E、BoNT/F和BoNT/X三种肉毒毒素蛋白酶进行重新设计，在保留催化中心和底物结合区域的基础上优化其他氨基酸序列，并利用AlphaFold2验证结构稳定性。随后，通过表达纯化、热稳定性测定和酶动力学实验筛选性能最佳的AI设计蛋白。之后，以天然蛋白和AI设计蛋白分别作为起点，在完全相同条件下开展多轮噬菌体辅助连续进化（PACE），针对多个不同难度底物进行平行进化，并结合高通量测序分析突变轨迹。最后，将获得的新型蛋白酶在人类细胞中验证表达水平、切割活性及底物特异性，并进一步针对神经退行性疾病相关蛋白Ataxin-2开展定向进化验证。

研究人员首先利用ProteinMPNN重新设计BoNT蛋白酶序列，在保持催化位点和底物识别区域不变的情况下，对外围大量氨基酸进行优化。

实验结果显示，大多数AI设计蛋白仍然保持天然催化能力，其中约四分之一蛋白不仅保持活性，而且可溶表达明显提高。进一步筛选出的几个代表性设计蛋白表现尤为突出，其表达量显著高于天然BoNT/E，同时热稳定性明显增强，熔解温度提高数摄氏度。

动力学分析进一步表明，AI重新设计不仅没有降低催化效率，反而使多个设计蛋白催化效率提高约2倍以上。在细菌连续进化筛选系统中，这些AI设计蛋白也表现出更强的底物切割能力，为后续连续进化提供了更高起始适应度。

说明ProteinMPNN能够有效恢复实验进化过程中丢失的稳定性，同时保持甚至提高天然酶活性。

图1: AI重新设计提高BoNT蛋白酶稳定性、表达水平和催化效率。

研究人员随后进一步提出一个更具挑战性的问题：对于已经经过定向进化获得新功能、但稳定性明显下降的蛋白，AI是否能够重新优化其整体性能？

他们选择此前已经成功改造、能够识别PTEN的新型BoNT蛋白酶进行测试。这种蛋白虽然已经获得新底物识别能力，但表达量下降，稳定性明显减弱。

研究人员将ProteinMPNN设计得到的新序列与此前获得的新功能突变重新组合。

结果发现，新蛋白不仅完整保留PTEN识别能力，而且可溶表达恢复数倍以上，热稳定性显著提高，在人细胞中PTEN切割效率明显增强，同时几乎完全丧失天然SNAP25切割活性。

这一结果说明，AI不仅适用于天然蛋白，也能够重新优化已经经过实验进化的蛋白，使其获得更好的综合性能。

图2: AI重新设计恢复实验进化蛋白稳定性，并保持新的底物特异性。

研究人员随后开展本研究最核心实验——比较天然蛋白与AI设计蛋白作为连续进化起点的差异。

他们针对三个不同难度底物，同时开展多轮平行PACE实验。结果令人十分一致。在所有进化任务中，以AI设计蛋白作为起点获得的新蛋白活性始终高于天然蛋白路线。

对于难度最低的底物，两类蛋白最终都获得较高活性，但AI起点获得的蛋白催化能力始终更强。随着底物难度不断增加，两者差距进一步扩大。特别是在中等难度底物中，AI起点不仅更快获得适应突变，而且仅需较少突变即可达到天然蛋白需要更多轮进化才能实现的活性。

最困难底物中，两条天然蛋白进化路线甚至完全失败，而所有AI设计起点均成功获得具有明显活性的蛋白。进一步分析突变发现，大量AI路线获得的高活性突变如果直接放入天然蛋白中，几乎完全失效；相反，天然蛋白获得的大多数突变放入AI背景后仍能正常工作。

说明AI设计起点不仅提高稳定性，更重要的是改变了整个蛋白适应度景观，使原本无法存在的新突变组合成为可能。

图3: AI重新设计起点持续获得优于天然蛋白的连续进化结果，并拓展可进化序列空间。

为了进一步理解AI如何改变蛋白进化过程，研究人员利用长读长测序持续跟踪连续进化过程中不同突变组合出现的时间及频率。

结果发现，天然蛋白主要依赖多个补偿突变共同出现才能维持稳定，因此必须经过更多轮进化才能获得高活性蛋白。相比之下，AI设计蛋白由于本身更加稳定，许多单个有利突变即可产生明显活性，因此能够更早进入高适应性区域。

随着进化继续进行，AI路线不断产生天然蛋白完全没有出现的新突变组合，而且这些组合最终逐渐成为整个群体优势基因型。进一步利用蛋白语言模型进行序列空间分析发现，AI设计起点整体提高了附近大量序列适应度，使整个局部进化景观整体抬升，而不仅仅改善某几个突变。

这一结果说明，AI设计真正改变的是蛋白整个进化路径，而不仅仅提高起始稳定性。

图4: AI重新设计改变蛋白适应度景观，加快连续进化速度并拓展高适应性序列空间。

最后，研究人员将这一策略应用于更具挑战性的神经退行性疾病治疗相关蛋白Ataxin-2。Ataxin-2与肌萎缩侧索硬化症等疾病密切相关，而天然BoNT完全不能识别这一蛋白。

研究人员分别以天然BoNT和AI设计BoNT作为起点开展连续进化。最终，两条路线均获得能够切割Ataxin-2的新型蛋白酶，但AI路线表现明显更优。其催化效率更高，表达更稳定，并几乎完全消除天然SNAP25切割活性。

进一步动力学实验发现，AI路线获得的新蛋白对Ataxin-2底物具有更高催化效率，而对天然底物几乎没有检测到切割能力。综合计算后，其Ataxin-2选择性较天然蛋白路线提高79倍以上，达到目前最佳水平。

在人细胞中，AI路线蛋白同样表现出更高表达和更强Ataxin-2切割能力，为未来神经退行性疾病治疗提供新的候选工具。

图5: AI重新设计促进获得高活性、高特异性的Ataxin-2蛋白酶。

图6: AI辅助蛋白设计与连续进化协同提升蛋白质进化效率和最终性能。

研究人员提出了一种将人工智能蛋白设计与实验连续进化深度融合的新策略。传统ProteinMPNN主要用于提高蛋白稳定性，而PACE主要负责获得新功能，两者此前通常独立使用。本研究证明，两种技术结合后能够相互弥补不足：AI首先提高蛋白稳定性和表达能力，为后续连续进化提供更高质量起点；连续进化再进一步获得AI难以直接设计的新功能和新特异性。

更重要的是，本研究发现AI重新设计不仅提高蛋白稳定性，还从根本上改变了蛋白适应度景观。天然蛋白由于稳定性不足，需要不断积累补偿突变才能维持折叠，因此能够进入的序列空间十分有限。而AI设计蛋白具有更大的稳定性储备，使许多原本无法存活的高功能突变得以保留，从而进入天然蛋白无法到达的新进化区域。这也是AI路线始终能够获得更优最终结果的重要原因。

研究还证明，这种优势不仅适用于单一蛋白，而是在BoNT多个亚型及多个不同底物中均可重复观察，说明AI重新设计作为定向进化起点具有较好的普适性。

最后，研究人员指出，这一策略未来不仅适用于蛋白酶，也有望推广到聚合酶、碱基编辑器、逆转录酶以及其他复杂蛋白工程体系。随着ProteinMPNN等生成式AI模型持续发展，未来可首先利用AI快速构建高稳定性起始蛋白，再结合自动化连续进化获得目标功能，从而形成"AI设计—实验进化"闭环，加速新型蛋白药物、基因编辑工具及工业酶的开发，为蛋白质工程建立一种更加高效的新范式。

Krasnow, N.A., Xu, J.A., Zhang, E. et al. AI-redesigned starting points and outcomes enhance protein evolution. Nature (2026). 

https://doi.org/10.1038/s41586-026-10820-0