Nat. Commun. | 排序引导学习加速自动化酶工程

酶催化能够在温和条件下以较高的效率和选择性合成结构复杂的化合物，是绿色化学、药物制造和合成生物学的重要技术基础。然而，天然酶通常并不具备工业反应所需的底物适应性、催化活性或选择性，而蛋白质序列与功能之间又形成高度崎岖的适应度景观。传统定向进化依赖随机突变和大规模筛选，不仅实验负担较重，也容易局限在起始序列附近进行局部搜索。蛋白质语言模型虽然可以扩大序列空间探索范围，但其主要从天然序列中学习进化规律，未必能够准确反映特定非天然反应所需要的功能景观。

研究人员开发了排序引导的自动化酶重编程平台REAP，将蛋白质语言模型、排序—回归联合学习、主动学习和机器人实验整合为闭环系统。平台的核心模型PLM-RankReg采用冻结的蛋白质语言模型提取序列表示，再通过轻量预测网络学习特定酶反应。与仅预测绝对活性不同，RankReg同时学习不同变体之间的相对性能顺序和具体活性数值，使模型既能准确识别最值得测试的高性能候选，又能保持定量预测能力。实验结果持续反馈给模型，从而推动系统从广泛探索逐渐转向高活性区域的重点开发。

在细胞色素P450 BM3工程中，REAP经过五轮闭环优化，将针对非天然底物的目标羟化活性提高57倍，并发现了位于催化口袋、连接区和远端结构区域的多类功能位点。平台还从单点突变逐步扩展到双突变、三突变、四突变和五突变，识别出具有正上位效应的组合。将其用于催化机制和检测方式均不同的金黄色葡萄球菌分选酶A时，系统又获得最高约104倍的活性提升。研究表明，排序学习与自动化实验结合，可以在稀疏反馈条件下不断修正酶适应度模型，并加速高性能生物催化剂的发现。

酶具有高催化效率、底物特异性和环境友好等优势，已被广泛用于药物中间体、精细化学品和复杂天然产物的合成。工业酶工程通常需要同时改善催化活性、区域选择性、立体选择性、稳定性和表达水平。然而，一个蛋白质只要包含数百个氨基酸，其可能的单点和多点突变组合就会形成极为庞大的序列空间，无法依靠穷举实验完成筛选。

定向进化通过“突变—筛选—选择—再突变”的循环改善酶性能，是当前最成熟的酶改造策略。但随机文库中大多数突变通常无益甚至有害，实验资源因而大量消耗在低价值候选上。常规方法还往往优先关注催化口袋或既有文献报道的热点位点，可能忽略远端残基、结构连接区和构象调节位点。

蛋白质语言模型可以从海量天然蛋白质序列中学习氨基酸组合规律，并为突变序列生成上下文表示。这类表示有助于估计突变是否符合进化规律，却不一定能预测其在特定人工反应中的表现。自然选择主要维持生物体适应性和代谢平衡，而酶工程追求的可能是对非天然底物的极高活性。因此，天然序列概率较高的突变不一定具有最佳工程性能，天然序列中极少出现的突变反而可能适合人工催化任务。

在实际酶工程中，预测模型还面临训练数据不足的问题。初始阶段通常只有几十至数百个实验测量值，而且数据包含表达差异、检测误差和复杂突变相互作用。只优化数值误差的回归模型可能在平均意义上表现良好，却无法稳定地将最高活性变体排在前列。单独使用排序目标则可能识别相对顺序，但不能准确估计活性差距。研究人员因此提出将排序和回归统一到同一训练目标中，并通过自动化实验快速获得标准化反馈。

研究人员构建的REAP由排序—回归、主动探索、自动化实验和酶重编程四个相互连接的部分组成。系统首先利用蛋白质语言模型对候选序列编码，并以少量已测变体训练特定任务预测头。RankReg同时约束变体之间的相对排序和单个变体的定量活性，对于实验差异较大的样本对提出更强的排序要求，从而加强模型对明显优劣关系的学习。候选选择阶段使用由100个不同初始化模型构成的集成系统，同时估计平均预测活性和模型不确定性；早期轮次兼顾高预测值与高不确定性，用于探索尚未充分认识的序列区域，后期则更加重视高活性候选。入选序列进入机器人实验流程，依次完成突变文库构建、菌株转化、蛋白表达、细胞破碎、酶量归一化和功能检测。平台支持质谱直接测量产物，也支持荧光底物检测，并通过序列验证、表达水平检查、信号过滤、重复性评估和数据标准化保证反馈质量。合格数据被加入训练集，重新更新预测模型，形成连续闭环。

在没有任务实验数据时，系统首先利用蛋白质语言模型进行零样本预测，从所有单点突变中选择少量高排名变体作为初始实验集合。获得第一批测量结果后，REAP不再单纯依赖天然序列知识，而是使用与目标反应直接相关的实验数据重新训练模型。此后每一轮都由模型设计候选、机器人完成构建和检测、实验结果反馈模型。

自动化流程覆盖从DNA文库到酶活测量的主要步骤。蛋白表达后，系统首先校正不同变体之间的酶量差异，避免将高表达误判为高催化活性。对于P450 BM3，平台采用声学液滴喷射质谱直接测量目标产物；对于分选酶A，则采用荧光去淬灭反应读取催化速率。不同检测方式产生的数据经过统一质量控制后均可用于模型更新，使REAP不依赖单一实验格式。

该平台每周能够构建和筛选超过2000个变体，并将一轮设计、构建、测试和学习压缩至约一周。闭环并不是简单重复筛选，而是使候选分布随实验反馈发生变化：初期强调不确定区域，后期逐渐聚焦高活性区域。

图1｜REAP闭环自动化酶工程平台。

研究人员比较了多种蛋白质语言模型和预测头。综合多个酶活性数据集后，中等规模的ESM2模型配合多层感知机预测头获得了较稳定的表现。最终确定模型结构和超参数后，所有后续评估均采用固定设置，以避免针对测试数据调参。

在ProteinGym的212个深度突变扫描数据集上，RankReg的突变排名相关性显著高于均方误差、Huber损失和绝对误差等仅使用点式监督的模型。同时，其标准化预测误差也更低，说明加入排序学习并没有牺牲绝对数值预测，反而改善了模型校准。

少样本实验进一步模拟真实酶工程场景。训练集仅包含50、100、200或400个单点突变，测试集则包括剩余单突变和多突变。在仅有50个样本时，RankReg与随机森林方法表现接近；随着实验数据增加，其优势逐步扩大。在100个训练样本条件下，RankReg已在全部八个测试数据集上超过普通点式损失模型；达到400个样本时，其总体排名性能最佳，并且不同随机重复间的波动更小。这说明排序—回归联合学习特别适合不断积累实验数据的闭环系统。

图2｜RankReg的酶适应度预测性能。

研究人员选择P450 BM3催化非天然底物脱氧鬼臼毒素的C4β位羟化作为主要测试任务，目标产物是具有重要药物合成价值的表鬼臼毒素。经过初步筛选，含有16个已有突变的FL#62被选为起始酶。

在零样本初始化中，模型对全部可能单点突变评分，并选择32个候选进行实验。其中S81L活性约为起始酶的2.99倍。自动化粗裂解液检测与纯化酶实验高度相关，多次独立实验的相关系数均超过0.98，证明系统可以在无需逐个纯化蛋白的情况下进行可靠筛选。

REAP随后完成五轮工程循环。前三轮每轮测试93个单点突变，后两轮转向双突变和更高阶组合。各轮最佳变体相对于起始酶的活性依次提高约2.37、6.06、9.76、25.87和44.93倍。随着突变数量增加，不仅最佳变体活性提高，整个候选群体的中位活性也持续上升，说明模型并非偶然找到单个高值，而是在逐步富集有利序列。

超过1300个P450 BM3变体接受了自动化测量。模型在五折交叉验证中显著优于普通点式损失，在仅用单点突变训练并预测多点变体时也表现出较强外推能力。最终构建的五点突变体S81M、T180L、E207L、A330E和R498V获得57倍目标产物提升，是所有测试变体中活性最高者。

图3｜REAP引导的P450 BM3逐轮进化。

前三轮单点突变实验显示，REAP的搜索策略随反馈发生了明显变化。第一轮在整个蛋白质中广泛采样，其中包括远离催化中心的还原酶结构域。第二轮开始向P450催化结构域集中，第三轮则明显聚焦于75、330、332和354等靠近底物结合口袋的关键位点。

模型推荐突变中，实验验证为有益的比例由第一轮的42.6%提高至第三轮的63.4%。饱和突变验证也显示，在模型推荐的27个位点中，有12个位点能够产生超过最佳非模型推荐参考突变的变体。模型因此不仅能够发现已知功能区，还能较准确地推荐具体氨基酸替换。

部分有益位点位于传统活性中心之外，包括P450结构域表面的207位、催化域与还原酶域连接区的466和467位，以及接近FAD结合区域的498位。这些远端突变可能通过电子传递、结构柔性或长距离构象耦联影响催化。与此同时，活性提升幅度最大的突变仍主要富集于催化口袋周围，说明闭环学习能够同时保留远端探索能力，并逐步识别对当前反应最关键的结构区域。

图4｜PLM-RankReg对P450 BM3功能位点的迭代识别。

单点突变的效果不能简单相加，因为一个突变的作用可能依赖其他突变形成的结构背景。REAP在第四轮系统测试双突变，第五轮进一步测试双突变、三突变和四突变。组合候选完全由模型生成，没有额外加入人工挑选的合理设计组合。

实验表明，出现正上位效应的比例随突变阶数上升：双突变约为36%，三突变约为44%，四突变超过53%。这些相互作用既存在于空间邻近残基之间，也存在于距离较远的位点之间，提示长程构象耦联参与了高活性组合形成。

在高活性双突变网络中，A330Y是最突出的中心节点，出现在20个最佳双突变中的15个。A330E、S81M、T180F、E207L和R498V也频繁参与高性能组合。路径分析进一步追踪了从起始酶到高阶变体的突变积累过程，并确定S81M、T180L、E207L、A330E和R498V为核心组合。由此构建的五突变体取得57倍提升。

动力学分析显示，该变体的表观底物亲和力明显增强，催化周转速率提高约16倍，整体催化效率提高约64倍。分子动力学模拟也支持突变体与底物形成更有利的结合。由此可见，REAP获得的性能提升同时来自底物结合和催化步骤的改善，但P450 BM3中的主要贡献更偏向催化周转加快。

图5｜REAP设计的P450 BM3组合突变及其上位效应。

为验证平台是否仅适用于P450体系，研究人员将REAP用于金黄色葡萄球菌分选酶A。该酶识别LPXTG序列并催化转肽反应，在蛋白质标记、环化和生物偶联中具有重要应用。它与P450 BM3在催化机制、底物类型、蛋白质结构和检测方式上均明显不同。

研究人员建立荧光去淬灭活性检测，完成零样本初始化和五轮闭环优化。前三轮测试单点突变，后两轮探索双突变、三突变和四突变。随着轮次推进，活性分布和最佳变体均持续提高，最高变体达到起始酶约104倍活性。

早期模型推荐位点分布较广，第二轮开始向催化中心集中，第三轮进一步富集于与底物识别和构象变化相关的多个环区。除已知的94、160和165位外，系统还识别出126、185和200等较少报道的潜在功能位点。

组合突变表现出更强的上位效应，正上位效应比例从双突变约35%提高到三突变约74%，四突变接近87%。一个单独活性较弱的D170Q突变，在特定四突变背景中却表现出明显优势，说明仅依据单点性能筛选可能会过早丢弃具有组合价值的突变。

最佳四突变体主要包含P126、D160、D165和D185等位点，两个最高活性变体均超过100倍提升。动力学分析显示，分选酶A的改进主要来自表观底物亲和力增强，同时也伴随催化周转提升。这与P450 BM3主要通过提高周转速率不同，说明REAP能够在不同酶体系中发现不同的性能改进路径。

图6｜REAP在分选酶A工程中的泛化验证。

REAP的核心价值不只是将机器学习和机器人设备放在同一平台，而是形成真正以实验反馈驱动的适应性学习循环。蛋白质语言模型提供初始序列知识，RankReg从少量实验中学习目标反应的相对顺序和定量差异，主动学习平衡未知区域探索与高活性区域开发，自动化系统则持续产生可比较的数据。

排序目标特别符合酶工程的实际需要。研究人员通常不要求模型准确预测所有变体的绝对活性，而更关心能否从成千上万的候选中优先选出少量最佳序列。RankReg保留回归监督，因此也没有放弃数值尺度信息。随着反馈数据增多，联合学习的优势逐渐超过仅依赖随机森林或点式损失的方法。

两个酶体系中的结果还表明，高阶工程不能简单地把最佳单点突变相加。部分单点作用较弱的突变，在特定背景下可以形成强烈正上位效应；远距离残基之间同样可能通过构象网络产生协同作用。REAP通过逐轮测试和更新模型，使这些背景依赖关系能够进入后续设计。

该平台仍存在限制。其推广依赖快速、准确且可自动化的酶活检测，并非所有酶都具有适合质谱或荧光读取的实验体系。目前系统主要优化单一目标，而工业应用往往需要同时考虑活性、选择性、稳定性、可溶性和表达水平。未来可将蛋白质结构、动态构象和逆折叠模型纳入预测，发展多目标优化，并使用更通用的无标记检测技术。

此外，虽然系统已在少量轮次中取得显著提升，但实际探索的序列空间仍极小。扩大机器人通量、提高克隆鉴定效率和检测灵敏度，可能帮助系统发现更加稀有的远端组合和高阶上位效应。随着标准化自动化接口和云端实验基础设施发展，类似REAP的平台有望从单个实验室的闭环装置，进一步发展为可共享数据并持续学习的分布式自主蛋白质工程系统。

Xu, J., Zheng, Y., Sundarraj, R. et al. Rank-guided learning accelerates automated enzyme engineering. Nat Commun (2026). 

https://doi.org/10.1038/s41467-026-76264-2