Nature | 从核磁共振谱的缺失信息中解析蛋白质毫秒尺度动力学

蛋白质并非静态结构，其催化、配体结合、变构调控和分子识别等功能往往依赖多个构象之间在微秒至毫秒（µs–ms）时间尺度上的转换。然而，与静态蛋白质结构相比，可用于机器学习的标准化动力学实验数据极为有限，这一直制约着蛋白质动力学预测模型的发展。研究人员整理了超过100套核磁共振（NMR）弛豫数据后注意到，一种潜在的动力学信息实际上长期存在于NMR数据中：当残基发生µs–ms尺度构象交换时，其NMR信号可能因交换展宽而弱化甚至完全消失，因此在化学位移数据中表现为“无法指认”的残基。基于这一认识，研究人员将BMRB中大规模存在的缺失主链酰胺指认作为µs–ms动力学的代理标签，并训练深度学习模型预测这些缺失信号。结果表明，模型不仅能够预测NMR指认缺失，还能够迁移到独立NMR弛豫实验中预测真实构象交换。表现最佳的模型Dyna-1利用多模态蛋白质语言模型ESM-3第22层的序列与结构表示，尤其能够识别与催化、配体结合等生物学功能相关的动态区域。研究由此表明，NMR谱中“没有出现的信号”本身可以成为学习蛋白质动力学的大规模实验信息来源。

蛋白质结构预测近年来取得了巨大进展，但预测“蛋白质如何运动”仍远远困难于预测单一静态结构。关键原因之一是缺乏类似PDB那样规模大、格式统一并适合训练模型的蛋白质动力学数据库。尤其是µs–ms尺度运动，它们通常与催化、变构、配体结合以及构象选择直接相关，却难以从常规静态结构中获得。

NMR为研究这一时间尺度提供了独特窗口。构象交换会改变原子局部化学环境，并在横向弛豫中形成额外的交换贡献Rex。然而，传统R1、R2和异核NOE数据分散在数十年的文献、数据库和补充材料中，难以形成大规模训练数据。研究人员首先整理出RelaxDB，对133个折叠良好、单体、无配体的蛋白质进行统一处理。分析发现，发生µs–ms交换的残基比普通残基更加保守，而具有快速ps–ns运动的残基保守性最低。更重要的是，那些由于NMR信号缺失而无法完成主链指认的残基，与具有Rex的残基表现出几乎相同的序列保守性。这提示“缺失指认”可能并非单纯的数据缺陷，而是在记录隐藏的构象动力学。

研究人员首先从BMRB、已发表论文的补充数据、图像数字化结果以及研究人员提供的数据中收集R1、R2和异核NOE数据，并构建RelaxDB。为了区分分子整体各向异性转动与真实构象交换，研究人员利用AlphaFold2预测结构，再通过HYDRONMR计算刚性分子转动条件下的理论弛豫行为，根据实验值相对于理论值的异常升高识别µs–ms交换，同时根据异核NOE识别ps–ns快速运动。随后，研究人员从BMRB约1.2万个蛋白质实体出发，去除氘代、选择性标记、过短序列、明显不完整指认以及整段结构域缺失等可能产生系统性假阳性的样本，最终获得包含9,381个蛋白质的mBMRB数据集，并将每个残基是否存在主链^15N指认作为训练标签。模型方面比较了简单序列/二级结构基线、ESM-2表示、AlphaFold2 pair representation以及ESM-3表示；预训练模型参数保持冻结，其输出输入到逐残基Transformer分类器。最终Dyna-1采用ESM-3第22层的序列和结构联合表示，并采用严格的30%序列同一性和0.5 TM-score结构相似性阈值划分训练数据，以降低同源信息泄漏。独立评估使用RelaxDB以及直接测量构象交换的RelaxDB-CPMG数据，最后又选择两个此前缺乏弛豫数据的蛋白质开展新的^15N CPMG实验进行前瞻性验证。

RelaxDB最初包含163个蛋白质数据集，经质量控制后保留133个。统一分析显示，µs–ms交换残基的进化保守性最高，无明显动力学标签的残基居中，而发生ps–ns快速运动的残基保守性最低。这一规律与µs–ms动力学经常参与催化、配体结合和变构调控相吻合。相比之下，AlphaFold2的pLDDT能够较明显反映快速柔性区域，却难以区分静态残基和µs–ms交换残基，因此静态结构预测置信度不能直接替代动力学信息。

研究人员进一步发现，缺失主链NMR指认的残基具有与Rex交换残基几乎相同的保守性。这成为全文最关键的线索：信号“消失”本身可能就是构象交换的实验观测。

图1：RelaxDB的构建、不同时间尺度NMR动力学标签以及µs–ms交换残基的序列保守性分析。

RelaxDB只有133个蛋白质，不足以直接训练具有广泛泛化能力的模型。研究人员因此转向BMRB。经过系统过滤后，构建了包含9,381个蛋白质的mBMRB，其规模比RelaxDB大近两个数量级。

缺失指认并不等价于所有µs–ms动力学，因此这些标签不可避免含有噪声；同时，许多能够完成指认的残基实际上也可能存在构象交换。不过，大规模统计发现，缺失指认存在于各种氨基酸和二级结构环境中，在环区更加常见。进一步与X射线和冷冻电镜结构比较发现，NMR缺失残基与晶体或电镜结构中的未解析残基重叠很少，而且已指认与未指认残基的B因子分布相近，说明mBMRB包含的信息并不是静态结构无序性的简单重复。

图2：利用BMRB主链酰胺缺失指认构建mBMRB动力学代理数据集及其结构特征分析。

研究人员比较了多种蛋白质表示。ESM-2、AlphaFold2 pair representation和ESM-3均明显优于氨基酸组成、二级结构等简单基线，说明缺失NMR信号并非随机噪声，而是包含可以由蛋白质序列和结构学习的规律。

其中，同时输入序列和结构的ESM-3第22层模型表现最佳，在初始验证中AUROC约为0.77，ESM-2约为0.75，仅使用结构信息的AlphaFold2 pair representation约为0.71。即使采用30%序列同一性和0.5 TM-score的严格去同源划分，Dyna-1仍获得约0.74的验证AUROC，而且增加近三倍训练数据并未带来明显性能提升，表明模型并非主要依赖近同源序列记忆。

图3：mBMRB训练与测试流程、不同蛋白质基础模型比较以及Dyna-1预测实例。

真正关键的问题是：一个仅以“是否缺失NMR指认”为训练目标的模型，能否预测那些仍能够被指认、但通过弛豫实验证实存在交换的残基？RelaxDB测试表明答案是肯定的。虽然性能较预测缺失指认有所下降，但ESM-3、ESM-2和AlphaFold2表示均明显优于基线，其中Dyna-1表现最佳。

进一步分析还暴露出实验数据本身的问题。一些DNA或RNA结合蛋白在磷酸盐缓冲液中测量时，表面带正电残基可能由于非特异性磷酸根结合表现出额外R2，而Dyna-1并不会将这种实验条件导致的交换预测为内在动力学。去除这类样本后，整体AUROC由0.63提高到0.66。对于BPTI，Dyna-1准确识别了与二硫键异构化相关的动态环区，AUROC达到0.92。模型在黄素结合、核输出、底物识别和酶特异性调控相关区域中同样给出了较高交换概率，而且对高度保守的核心残基预测能力最强。

图4：Dyna-1在RelaxDB中预测具有生物学功能意义的µs–ms构象交换。

研究人员随后使用更直接的^15N CPMG弛豫色散数据验证Dyna-1。令人关注的是，Dyna-1在Cyclophilin A中将Arg148预测为高交换概率，但传统CPMG处理并未把该位点判定为交换。重新检查原始数据发现，该残基在所有脉冲频率下都保持异常高的有效R2，提示其交换过程过快，在实验采用的CPMG场强范围内没有被充分抑制。

研究人员因此利用HYDRONMR估计刚性转动背景，建立识别这种“未被抑制Rex”的重新处理流程。在具有完整色散数据的6个蛋白质中，加入这些此前遗漏的交换标签后，5个蛋白质的Dyna-1评价性能提高。模型还正确定位了Cyclophilin A催化相关区域、K-Ras switch I/II以及与辅酶结合相关的动态区域，说明其部分所谓“假阳性”实际上可能是传统实验分析遗漏的真实动力学。

图5：Dyna-1识别传统CPMG分析未检测到的快速构象交换及重新分析结果。

为了避免仅依赖历史数据进行回顾性验证，研究人员从mBMRB测试集中选择两个尚无公开弛豫数据、但Dyna-1预测截然不同的蛋白质进行新实验：高交换概率的苔藓几丁质酶Chitinase 19，以及低交换概率的假定蛋白yjbJ。

新的^15N CPMG实验与预测总体一致。Chitinase 19存在广泛构象交换，尤其集中在催化活性位点和几丁质结合环区域；而yjbJ几乎没有明显交换，仅N端两个残基表现出可检测色散。逐残基评价中，Dyna-1在Chitinase 19和yjbJ上的AUROC分别为0.62和0.72。这一前瞻性实验直接证明，模型能够在此前没有弛豫实验数据的蛋白质上预测真实动力学趋势。

图6：Dyna-1对Chitinase 19和yjbJ蛋白动力学预测的前瞻性CPMG实验验证。

这项工作的核心贡献并不只是提出一个新的蛋白质动力学预测模型，而是重新定义了一类长期被视为“不完整数据”的NMR信息。过去，人们通常关注谱图中出现了什么峰，而研究人员证明，某些“没有出现的峰”同样蕴含明确的物理和生物学信息。通过将BMRB中的缺失主链指认转换为大规模弱监督标签，原本只有百余个蛋白质的标准化动力学数据被扩展到近万个蛋白质，使蛋白质语言模型第一次能够从大规模实验信息中学习µs–ms动力学规律。

Dyna-1也仍存在明显限制。缺失指认只是构象交换的不完整代理，实验条件、谱峰重叠、样品标记以及快速柔性均可能产生噪声；模型目前仍难以完全区分ps–ns快速运动与µs–ms交换。此外，ESM-3基础表示没有显式利用完整侧链信息，Dyna-1的训练蛋白主要短于400个残基，因此对大型、多结构域体系的泛化仍需进一步验证。研究人员还发现，更宽松的训练集虽然带来接近三倍的数据量，但性能提升很小，提示下一阶段突破可能更多依赖模型架构和更高质量动力学实验数据，而不是单纯扩大现有弱标签数据集。

更重要的是，这项研究强调了原始NMR谱图标准化保存的重要性。如果过去数十年的研究不仅保存最终化学位移指认，还系统保存代表性谱图、峰宽和弛豫信息，那么今天可用于学习蛋白质动力学的实验数据规模可能远大于RelaxDB。Dyna-1因此既是一个动力学预测模型，也展示了一种更普遍的研究范式：利用已有实验数据库中长期被忽略的“缺失信息”，构建能够连接蛋白质序列、结构、动力学与功能的大规模学习体系。

Wayment-Steele, H.K., El Nesr, G., Hettiarachchi, R. et al. Learning millisecond protein dynamics from what is missing in NMR spectra. Nature (2026). 

https://doi.org/10.1038/s41586-026-10989-4