Nat. Biotechnol. | 面向先导编辑结果预测的机制机器学习

先导编辑（prime editing，PE）能够在不产生DNA双链断裂、也不依赖外源供体DNA的情况下，对基因组实现多种碱基替换、小片段插入和缺失，因此具有重要的精准基因治疗潜力。然而，PE效率高度依赖先导编辑向导RNA（pegRNA）的设计，包括靶向序列、逆转录模板（RTT）、引物结合区（PBS）以及是否加入额外沉默突变等参数。对于一个目标编辑，往往存在数百甚至数千种潜在组合，因此寻找高效pegRNA仍需要大量实验筛选。

研究人员提出OptiPrime，一种将当前先导编辑分子机制直接写入模型结构的机制驱动机器学习方法。与将所有序列特征输入单一黑箱模型不同，OptiPrime把PE过程拆分为Cas9结合与切口形成、逆转录和3′ flap形成、错配修复（MMR）识别以及MMR非依赖性DNA修复等多个步骤，并分别学习代表这些步骤有效动力学的“伪速率”，再通过时间演化模型得到最终编辑效率。模型联合训练了来自40种实验环境的297,962个PE测量结果，并在独立测试中优于现有预测模型。更重要的是，OptiPrime学习到的伪速率能够重现MMR的已知规律，并可迁移至训练时未直接涉及的PE3和twinPE体系。最终，模型被用于多个治疗性编辑任务，并在Kif1a疾病小鼠模型中指导快速建立体内编辑方案，在脑皮层整体组织中实现超过40%的平均校正率，在转导细胞中达到70%以上。

先导编辑通过Cas9切口酶与逆转录酶组成的编辑器，在pegRNA引导下识别目标DNA。pegRNA除了包含决定靶向位置的spacer，还携带编码目标编辑的RTT以及与切口DNA退火并启动逆转录的PBS。编辑器完成切口和逆转录后形成包含编辑序列的DNA中间体，随后还需要经过3′ flap处理、异源双链形成以及DNA修复，才能最终固定目标改变。因此，最终效率并不是由单一序列特征决定，而是多个连续分子过程共同作用的结果。

其中，MMR是PE效率的重要限制因素。编辑后形成的异源双链可能被MutSα或MutSβ识别，并进一步招募修复系统将编辑序列恢复为原始序列。研究人员此前发现，抑制MMR的PE4策略能够显著提高编辑效率；另外，在目标编辑附近加入不改变蛋白质序列的沉默突变，可以增加异源双链中的错配范围，使其更难被MMR识别，从而获得类似效果。

现有PRIDICT、DeepPrime等模型虽然能够从大规模数据中学习pegRNA与编辑效率之间的关系，但通常采用黑箱式预测。它们可能擅长区分明显低效与高效的pegRNA，却较难从一组本身都经过经验优化的候选序列中进一步寻找最佳设计。此外，黑箱模型内部变量没有直接对应具体分子步骤，因此较难解释为何某一设计有效，也不容易迁移到PE3、twinPE等机制发生变化的编辑体系。研究人员由此提出：如果直接用已知PE反应机制约束机器学习模型，可能同时提高预测精度、可解释性和跨任务泛化能力。

研究人员首先建立Lib-MMR和Lib-CV两个高通量pegRNA库。Lib-MMR包含约1万个pegRNA，覆盖单碱基替换、多碱基替换、插入和缺失，用于系统研究MMR对不同编辑中间体的影响；Lib-CV则包含10,406个pegRNA，针对944种ClinVar致病变异，并为多数目标加入不同的沉默突变组合。研究在MMR较弱的HEK293T和MMR完整的HeLa细胞中分别进行PE2和加入MLH1dn的PE4筛选，获得74,769个编辑效率测量。随后将这些结果与已有数据整合，形成覆盖40种实验背景、共297,962个PE效率的训练集合。OptiPrime按照假设的PE机制建立多个状态及状态间转移过程，其中DNA结合和切口、flap合成等步骤由手工选择的相关特征预测，MMR相关异源双链识别和修复则利用研究中新建立的HetFormer网络建模；HetFormer预先在6,400万个模拟异源双链上训练。各模块预测的伪速率被置入机制模型，并根据实验持续时间模拟状态随时间的变化，最终得到预测编辑率。训练和测试按照protospacer分组进行五折交叉验证，以避免相似靶序列泄漏。

图1：先导编辑的分子机制、可实现的编辑类型以及pegRNA设计所涉及的高维参数搜索空间。

在Lib-MMR筛选中，PE4总体明显优于PE2，而这种差异在MMR完整的HeLa细胞中更加突出。HeLa中PE4相对于PE2的中位效率提升约4.3倍，而HEK293T中仅约1.5倍，符合后者部分缺乏MMR功能的特征。

研究人员进一步以PE4与PE2效率比值衡量一个编辑中间体受MMR抑制的程度。不同单碱基替换表现出稳定的差异，且与已知错配DNA被MMR识别的规律一致。随着连续替换长度增加，PE4相对于PE2的优势逐渐下降，说明较大的错配区域反而不容易被MutS蛋白有效识别。插入和缺失也呈现类似的长度依赖性，而且相同长度的插入与缺失之间存在明显差异。

Lib-CV进一步显示，在目标校正附近加入沉默突变能够提高PE2效率，而且提升程度与原始编辑受到MMR抑制的程度相关。这些结果确认，沉默突变的主要作用之一是改变异源双链结构，使编辑中间体逃避MMR识别。

图2：高通量pegRNA–靶位点筛选及不同替换、插入、缺失和沉默突变对MMR依赖性先导编辑效率的影响。

OptiPrime没有直接从所有输入特征预测最终效率，而是先预测不同反应步骤的伪速率，再让编辑体系沿预设机制随时间演化。这使模型在数学结构上对应实际PE过程，而不是简单的序列到效率映射。

在五折交叉验证中，OptiPrime在研究中新获得的数据上平均Pearson相关系数约为0.693，Spearman相关系数约为0.745，明显优于DeepPrime-FT和PRIDICT2.0。在独立测试集中，四种实验条件下平均Pearson相关系数达到0.723，Spearman相关系数达到0.775。

消融实验进一步证明，性能优势来自机制结构本身。去掉时间演化层、取消HetFormer预训练，或者随机打乱各伪速率模块与机制步骤之间的对应关系，都会显著降低预测性能。特别是将模型模块随机分配到不相干的反应边后表现明显恶化，说明并不是“更复杂的神经网络”带来了结果，而是模块与真实生物学过程之间的正确对应关系发挥了作用。

图3：OptiPrime的机制驱动架构，将先导编辑拆解为多个生化状态和伪速率，并通过时间演化预测最终编辑效率。

机制模型的另一优势是内部变量可以与实验现象比较。OptiPrime预测的MMR伪速率在PE4条件下比PE2中位下降约14倍，与MLH1dn抑制MMR的作用完全一致。模型预测的MutS复合物解离速率也与实验测得的PE4:PE2比值显著相关：MutS结合越稳定，即预测解离越慢，编辑中间体越容易被MMR识别并恢复为未编辑状态。

更重要的是，OptiPrime预测的PE4:PE2比值与实验测量具有良好一致性，Pearson相关系数为0.582，Spearman相关系数为0.668。这说明HetFormer不仅提高了整体预测准确性，还确实学习到了影响哺乳动物MMR识别的序列规律，因此可以用于寻找最有可能逃避MMR的沉默突变组合。

图4：OptiPrime与现有模型的预测性能比较、机制消融实验，以及模型内部伪速率与真实MMR行为之间的对应关系。

研究人员随后测试一个重要问题：如果模型确实学习了相对独立的机制模块，这些模块是否可以重新组合并用于没有直接训练过的新编辑体系？

对于PE3，研究人员整理940个PE3或PE5实验结果，并利用OptiPrime已有伪速率以及预测的PE2/PE4效率训练新的梯度提升模型。模型在ATP1A3相关实验测试集中平均Spearman相关系数达到0.534，而如果去掉OptiPrime提供的机制特征，相关性几乎消失，仅约0.025。进一步解释表明，PE结合速率、OptiPrime预测的基础编辑效率以及MutS解离速率都是最重要的PE3预测变量。

对于使用两条pegRNA产生互补3′ flap的twinPE，研究人员则直接提取OptiPrime中与flap合成有关的模块，而忽略经典PE中后续异源双链修复步骤。在667个twinPE实验组成的四个数据集中，即使模型从未接受twinPE训练，也获得平均Spearman相关系数约0.412。结果表明，机制模型可以“拆开再重组”，这是传统端到端黑箱预测器很难实现的能力。

研究人员进一步将OptiPrime用于多个治疗相关场景，包括CFTR致病突变、COL7A1突变、原代T细胞中的正交IL-2受体编辑以及大DNA片段整合。

在RDEB患者来源成纤维细胞中，针对COL7A1 p.R185X突变，三个OptiPrime候选中的最佳pegRNA实现37%的校正，而PRIDICT2.0和DeepPrime选择的6个候选均未超过5%。 在原代人T细胞中，OptiPrime设计的沉默突变pegRNA实现7.0%的IL2RB双突变编辑，而此前在HEK293T中人工筛选24条pegRNA获得的最佳设计仅约1.1%。

在twinPE基础的大DNA整合任务中，研究人员使用OptiPrime设计在CFTR内含子中安装Bxb1整合位点。最佳模型推荐的epegRNA组合实现约10%的多千碱基DNA整合，超过人工专家设计中的最佳结果8.0%。

这些实验说明，OptiPrime的价值不只是提高统计测试集上的相关系数，而是能够减少实际治疗开发中需要合成和测试的pegRNA数量。

图5：OptiPrime网页设计平台及其在CFTR、COL7A1、原代人T细胞和大DNA片段整合等治疗相关任务中的实验验证。

为了验证这种设计方式是否能够真正缩短个体化治疗策略开发周期，研究人员选择Kif1a“leg dragger”小鼠模型。该模型携带导致p.L181F改变的致病突变，并出现与人类KIF1A相关神经系统疾病相似的运动异常。

研究首先仅测试OptiPrime排名最高的8种沉默突变组合，迅速确定OP-5；随后再测试不同RTT和PBS长度，总共只使用15条pegRNA便获得OP-5.4，在杂合小鼠胚胎成纤维细胞中无需额外nsgRNA即可达到22%校正。随后筛选15条nsgRNA，+65和+114分别将编辑提高至39%和23%。再结合进化型PE6b编辑器后，两种策略分别达到64%和51%的编辑效率。整个优化过程仅经历4轮实验，大约4周完成，而此前类似治疗性PE项目通常需要筛选数百条pegRNA。

最后，研究人员通过双AAV9递送PE6b、OP-5.4 epegRNA以及nsgRNA，对新生Kif1a突变小鼠进行脑室内注射。4周后，脑皮层整体组织的平均校正率超过40%，而在GFP阳性的实际转导细胞中编辑效率超过70%；在整体组织转录本层面，超过一半Kif1a转录本得到校正。

图6：OptiPrime指导Kif1a致病突变的快速pegRNA、nsgRNA和编辑器优化，并通过AAV9在小鼠中实现高效率脑内体内校正。

这项研究的核心贡献不仅是提出了一个性能更高的先导编辑预测器，而是展示了一种不同的机器学习建模范式：不让模型从数据中自行猜测整个生物学过程，而是先由研究人员提供合理的机制框架，再让机器学习负责估计其中难以直接测量的局部过程。

这种设计带来了三个明显优势。首先，机制先验提高了数据利用效率和跨实验条件泛化能力，使来自不同细胞、不同编辑器和不同实验条件的数据可以在同一个体系中联合训练。其次，中间伪速率具有生物学含义，因此可以用MMR抑制、MutS结合等独立实验规律进行验证，而不像传统黑箱网络只能解释最终输出。第三，这些模块可以重新组合，用于PE3、twinPE等相关但机制不同的编辑模式，为真正意义上的机制迁移学习提供了示范。

不过，OptiPrime仍存在局限。模型部分依赖现有Cas9核酸酶活性评分，当这些评分与实际PE效率不一致时，预测性能会明显下降，因此未来需要开发PE专用的protospacer活性模型。其次，目前模型主要从随机整合的合成靶位点高通量数据训练，尚未显式考虑真实基因组中的染色质状态，而染色质可及性又具有明显的细胞类型特异性。进一步完善PE3、PE3b和twinPE的DNA修复机制，也有可能继续改善nsgRNA和双pegRNA选择。

更广泛地看，这项研究说明机制知识与机器学习并不是相互替代的两条路线。纯机制模型往往无法精确描述活细胞中复杂而未知的动力学参数，而纯数据驱动模型虽然具有较强拟合能力，却容易失去可解释性和跨机制迁移能力。OptiPrime采用的策略是在两者之间建立接口：已知部分由机制限定，未知部分交给神经网络学习。对于基因编辑、DNA修复、细胞信号传导以及其他具有明确中间状态却难以直接测量速率的复杂生物过程，这种“机制骨架＋机器学习参数化”的框架具有更普遍的方法学意义。

Hsu, A., Chen, P.J., Li, A.H. et al. Mechanistic machine learning for prediction of prime editing outcomes. Nat Biotechnol (2026). 

https://doi.org/10.1038/s41587-026-03261-7