Nat. Commun. | 药物筛选联合机器学习发现儿童痴呆潜在神经保护药物

儿童痴呆是一组以进行性神经认知功能下降为主要特征的儿科神经退行性疾病，其中许多疾病与成人痴呆共享溶酶体功能障碍、神经炎症和突触异常等病理机制。黏多糖贮积症IIIA型（MPS IIIA），又称Sanfilippo综合征A型，是较常见的儿童痴呆之一，由SGSH基因突变导致硫酸乙酰肝素降解障碍，目前缺乏能够有效阻止疾病进展的治疗方法。

研究人员利用5名MPS IIIA患儿和5名年龄匹配健康儿童来源的诱导多能干细胞（iPSC）建立人源皮层神经培养模型。患者来源神经培养物能够重现硫酸乙酰肝素蓄积、溶酶体异常、进行性神经元死亡、反应性星形胶质细胞增多以及神经网络异常等疾病特征。在此基础上，研究人员建立融合高内涵共聚焦成像、机器学习、单核RNA测序和电生理分析的多模态药物筛选平台，对63种具有再利用潜力的药物进行筛选。

研究最终鉴定出至少9种能够显著改善MPS IIIA细胞表型的候选药物，包括乙酰-D-亮氨酸、别嘌醇、去铁胺、羟氯喹、酮咯酸、锂、鲁米昔布、丙磺舒和茶碱。机器学习进一步从复杂成像特征中判断药物处理后的细胞是否由“MPS IIIA样”向“健康样”状态转变，其结果与传统表型分析高度一致。研究人员随后利用转录组学和电生理学深入验证领先候选药物，发现这些治疗不仅能够逆转部分异常基因表达，而且能够改善神经元兴奋/抑制失衡和网络过度兴奋。其中多药联合方案产生了更持久的神经网络恢复效应。

这项研究因此不仅筛选出一组具有药物再利用潜力的神经保护候选物，也建立了一套以患者来源细胞为基础、结合人工智能和多模态生物学验证的儿童神经退行性疾病药物发现策略。

iPSC技术能够保留患者遗传背景，并进一步分化形成神经元和胶质细胞，因此被认为是连接基础研究与临床药物开发的重要工具。与传统动物模型相比，人源iPSC模型更适合开展规模化药物筛选，也能够直接研究不同细胞类型中的疾病机制。然而，对于成年期神经退行性疾病，数十年的衰老过程很难在短期体外培养中完整重现。

儿童痴呆在这一方面具有特殊优势。许多儿童神经退行性疾病由高外显率单基因突变驱动，病理过程从生命早期就已经开始，因此可能更加适合目前偏向早期发育状态的iPSC神经模型。MPS IIIA就是典型代表。SGSH突变导致硫酸酯酶缺陷，使硫酸乙酰肝素无法正常降解并在溶酶体内持续积累，最终引发细胞稳态破坏、神经炎症和进行性神经退行性改变。

目前针对MPS IIIA的基因和酶替代治疗在非常年幼的患儿中显示出潜力，但很多患者直到4岁以后才能得到诊断，而部分疗法可能需要在30个月以前干预才能获得较好效果。因此，对于已经出现神经系统病理改变的儿童，能够减缓神经退行性过程、改善神经功能的药物仍然存在迫切需求。

研究人员由此提出，与其只针对SGSH缺陷本身，不如进一步寻找能够干预其下游共同病理过程的现有药物。通过患者来源神经细胞、规模化表型筛选和机器学习结合，可以直接判断一种药物是否真正将复杂疾病细胞状态推向“健康样”状态。

研究人员采集5名快速进展型MPS IIIA患儿和5名年龄匹配健康对照的皮肤成纤维细胞，将其重编程为iPSC，再经过皮层模式化、神经分化和最长120天成熟获得包含功能性皮层神经元和星形胶质细胞的培养体系。为兼顾患者遗传多样性与高通量实验需求，研究人员进一步将不同个体来源的细胞混合形成“playground”人源神经模型。疾病表型通过硫酸乙酰肝素、LAMP1、Lysotracker、MAP2、GFAP、caspase-3、阻抗等指标评价。随后选择63种具有药物再利用潜力的药物，从神经退行性、反应性星形胶质细胞增生、溶酶体异常和阻抗等多个维度筛选候选物。研究同时建立基于117项神经元特征和195项星形胶质细胞特征的XGBoost模型，并利用原始显微图像训练卷积神经网络，以判断细胞状态属于“健康样”还是“MPS IIIA样”。领先候选进一步通过单核RNA测序、基因通路分析、多电极阵列以及全细胞膜片钳进行机制和功能验证。

研究人员首先验证人源模型是否真正能够模拟疾病。健康和MPS IIIA来源细胞均可以形成成熟皮层神经元，表达浅层和深层皮层标志物，并能够产生超过10 Hz的动作电位，说明疾病细胞并不存在简单的神经分化失败。

真正的差异随着培养时间逐渐出现。MPS IIIA培养物在第30天的细胞内硫酸乙酰肝素已经达到健康组约10倍，到第90天扩大至约40倍；与此同时，培养液中的硫酸乙酰肝素也明显升高。Lysotracker和LAMP1检测进一步显示患者细胞的溶酶体数量和体积增加，表明疾病最核心的硫酸乙酰肝素贮积及溶酶体异常能够在体外重现。

图1｜MPS IIIA患者来源iPSC皮层神经培养体系的建立与疾病表型鉴定。 

随着培养时间延长，MPS IIIA模型进一步出现明显神经元丢失。MAP2染色显示患者来源神经元数量逐渐低于健康对照，单核RNA测序同样发现成熟和未成熟神经元比例降低。与此同时，神经元cleaved caspase-3升高，培养液LDH增加，并且LDH水平与神经元减少相关，说明观察到的变化主要反映真实神经细胞死亡，而非单纯细胞脱落。

与神经元减少相反，GFAP阳性星形胶质细胞明显增加，第30天已经接近健康组的3倍，并随培养进一步增强。SGSH缺陷星形胶质细胞中的C3d等炎症标志物升高，单细胞水平也观察到A1和A2反应性星形胶质细胞增加。因此，该模型同时重现了MPS IIIA的神经退行和神经免疫异常。

图2｜MPS IIIA人源神经培养物重现进行性神经退行和反应性星形胶质细胞增生。 

建立稳定疾病表型后，研究人员筛选63种具有再利用潜力的药物，覆盖神经调节、抗炎、免疫抑制、代谢、抗氧化、激素和心血管等类别。MPS IIIA培养物从第15天开始接受药物处理，并在第30天进行多维表型评价。

其中25种药物能够降低异常阻抗，13种能够显著减少神经元丢失，7种能够减少caspase阳性神经元，18种能够抑制异常星形胶质细胞增生。乙酰-D-亮氨酸、别嘌醇、去铁胺、酮咯酸、锂、鲁米昔布、丙磺舒和茶碱等在多个指标上表现出一致保护作用。

药物还影响疾病上游表型。25种候选中有7种显著减少细胞外硫酸乙酰肝素，部分候选同时降低细胞内硫酸乙酰肝素。别嘌醇、丙磺舒、乙酰-D-亮氨酸和去铁胺还能减少LAMP1阳性溶酶体，提示这些药物并非仅仅改善最终的细胞存活指标，也可能影响与疾病相关的溶酶体异常。

图3｜高通量药物筛选鉴定能够改善MPS IIIA疾病表型的再利用候选药物。 

研究人员随后不再依赖预先指定的单一疾病指标，而是利用机器学习直接判断整个细胞表型更接近“健康样”还是“MPS IIIA样”。

第一个XGBoost模型使用117项神经元图像特征，能够正确区分测试集中的健康和未经治疗的MPS IIIA培养孔。将其用于47种药物后，11种治疗使细胞显著向健康状态移动，其中8种达到较大效应。鲁米昔布处理后约85%的培养孔被判断为“健康样”。

第二个模型使用195项星形胶质细胞特征，同样几乎完全区分健康和疾病状态。药物处理后20种药物显著推动细胞向健康状态转变，其中别嘌醇处理的培养孔全部被判定为“健康样”。研究人员还直接以DAPI、MAP2和GFAP原始图像训练CNN，结果同样识别出14种具有显著改善作用的药物。

更重要的是，AI并没有产生一个与生物学实验完全不同的候选列表。神经元机器学习模型筛出的8种强效药物中有7种同时得到传统表型实验支持。综合神经元和星形胶质细胞结果，至少9种药物在多个分析维度中表现出保护作用。

图4｜机器学习识别能够将MPS IIIA细胞状态推向“健康样”的神经保护药物。 

为了进一步判断药物是否真正改变疾病分子状态，研究人员对30天培养物进行单核RNA测序。MPS IIIA神经元中共有508个基因相对于健康对照发生显著异常，而且不同患者表现出较高一致性，说明这一转录特征并非由单一患者驱动。

研究人员重点验证乙酰-D-亮氨酸、茶碱以及别嘌醇联合丙磺舒（AP）。乙酰-D-亮氨酸和AP均能够完全或部分恢复前20个上调基因中的12个，同时分别恢复19/20和20/20个主要下调基因。茶碱则恢复11/20个主要上调基因，但对下调基因的整体作用相对有限。

图5｜领先候选药物逆转MPS IIIA神经元和星形胶质细胞的异常基因表达。 

进一步分析显示，MPS IIIA中的神经元和星形胶质细胞并不是以相同方式受到疾病影响。神经元和星形胶质细胞拥有各自不同的异常基因集合，药物的恢复作用同样具有细胞类型依赖性。

这也解释了为什么单一表型很难完整评价治疗效果。有些药物主要改善神经元存活，而另一些药物更加明显地降低反应性星形胶质细胞。单纯使用阻抗作为筛选指标尤其可能产生偏差，因为阻抗同时受到神经元死亡和体积更大的星形胶质细胞增生影响。因此，将高内涵成像、细胞类型特异性转录组和机器学习结合，是该平台能够识别多维药物效应的重要原因。

图6｜领先候选药物对MPS IIIA神经元和星形胶质细胞转录异常的细胞类型特异性恢复。 

研究人员进一步通过基因本体和通路富集分析寻找异常基因背后的生物学过程。MPS IIIA神经元涉及神经发育、细胞代谢、细胞骨架和神经功能等多类异常过程；星形胶质细胞则突出表现为免疫反应增强、细胞骨架重塑和神经发育相关通路失调，与实验观察到的反应性星形胶质细胞表型高度吻合。

重要的是，被领先药物恢复的基因并非随机分布，而是集中于这些疾病相关功能网络。例如AP和乙酰-D-亮氨酸能够同时影响多个异常通路，而星形胶质细胞中恢复的免疫调节和细胞骨架相关通路与反应性状态的降低相对应。

因此，研究结果支持一种多通路疾病模型：SGSH缺陷和硫酸乙酰肝素积累可能位于疾病上游，而随后形成溶酶体损伤、炎症、星形胶质细胞反应、神经元稳态破坏和突触异常等相互关联的下游病理网络。治疗并不一定必须直接修复SGSH，而可以干预这些可药物化的下游节点。

图7｜基因本体分析揭示MPS IIIA中可被药物干预的异常分子通路。

最后，研究人员检验这些分子和细胞层面的改善能否真正转化为神经功能恢复。MPS IIIA神经元存在明显的兴奋/抑制失衡，其兴奋性/抑制性突触比健康细胞高约50%。别嘌醇与丙磺舒联合治疗能够显著将这一比例恢复至接近健康水平，而乙酰-D-亮氨酸、茶碱和卡马西平则表现出不同程度的改善趋势。

多电极阵列进一步显示，MPS IIIA神经网络具有异常高活动状态。卡马西平、AP以及由别嘌醇、丙磺舒、乙酰-D-亮氨酸和茶碱组成的四药联合方案APAT均能够在治疗期间降低过度活跃的神经元和爆发活动。但停药后的差异非常关键：卡马西平的作用在数日内迅速消失，而AP和APAT在停止治疗两周后仍保持对网络过度兴奋的抑制。

膜片钳进一步支持这种功能恢复。APAT能够降低异常自发兴奋性突触输入，而没有广泛抑制静息膜电位、电压门控离子电流或最大动作电位发放能力，提示其作用并非简单“让神经元安静下来”，而更可能通过改善疾病状态重新建立神经网络稳态。

图8｜候选药物改善MPS IIIA神经网络的兴奋/抑制失衡。

这项研究最重要的贡献之一，是建立了一个能够同时连接患者遗传背景、疾病表型、人工智能预测、转录组机制和神经网络功能的人源药物发现体系。研究人员并没有简单利用AI预测“哪个药可能有效”，而是首先证明患者来源iPSC神经培养物能够随时间产生硫酸乙酰肝素积累、溶酶体扩大、神经元死亡、反应性星形胶质细胞增生和神经网络异常，再让机器学习从真实疾病表型中寻找能够将细胞推回健康状态的药物。

这种设计也体现了机器学习在药物筛选中的一种更实际用途。传统筛选通常依赖单一终点，例如神经元数量或某个疾病标志物。但神经退行性疾病本质上具有多维表型，一个药物可能没有完全恢复神经元数量，却同时改善细胞形态、星形胶质反应和其他大量弱效特征。XGBoost和CNN能够综合这些高维信息，判断整个细胞状态是否向健康方向移动。机器学习与传统表型实验高度重叠，也从另一个角度增强了候选药物筛选的可信度。

研究最终得到的候选药物并没有集中于单一靶点。至少9种药物能够明显改善疾病表型，包括乙酰-D-亮氨酸、别嘌醇、去铁胺、羟氯喹、酮咯酸、锂、鲁米昔布、丙磺舒和茶碱。 这提示MPS IIIA虽然由明确的SGSH单基因缺陷引起，但神经退行过程可能由多个下游机制共同维持。硫酸乙酰肝素和溶酶体异常进一步影响炎症反应、星形胶质细胞状态、神经元稳态和突触活动，因此针对这些下游过程进行多靶点干预可能具有价值。

AP和APAT联合治疗的结果尤其值得关注。卡马西平能够迅速抑制异常神经活动，但停药后效果快速消失；相比之下，AP和APAT在停药两周后仍维持网络改善。研究人员据此提出，这种组合治疗可能不是单纯控制神经元放电，而是通过同时影响神经炎症、代谢、细胞稳态和神经信号等过程间接恢复突触稳态。多数候选药物本身并不直接作用于突触蛋白，也进一步支持MPS IIIA突触异常可能是硫酸乙酰肝素积累和溶酶体功能障碍的下游结果。

不过，这些结果仍属于临床前体外证据。研究筛选63种药物时每种药物主要采用单一剂量，因此对于没有显示效果的药物，不能证明其在其他剂量下无效；同样也无法由当前实验确定最佳治疗剂量。 “playground”模型虽然通过混合多个患者细胞提高了遗传多样性和筛选效率，但不同细胞系生长和存活速度存在差异，长期培养时可能出现个别患者细胞过度代表的问题。不过在进行主要药物筛选的第30天，各患者仍具有较好的比例代表性，而且单独细胞系和转录组分析总体支持药物效应具有跨患者一致性。

因此，这项工作目前不能说明这些现有药物已经可以直接用于MPS IIIA患儿，更不能将体外神经保护等同于临床疗效。下一步仍需要优化剂量和给药组合，并进一步研究药代动力学、血脑屏障暴露、安全性以及体内治疗效果。

总体而言，这项研究提供了一种具有推广价值的儿童神经退行性疾病药物发现范式：先利用患者iPSC建立能够自然呈现疾病进展的人源模型，再通过高内涵药物筛选产生多维表型数据，以机器学习识别“健康样”细胞状态，最后利用单细胞转录组和电生理验证候选药物是否真正恢复疾病相关分子与神经网络功能。 其意义不仅在于发现9种MPS IIIA潜在神经保护药物，更在于证明患者来源人源模型与机器学习、多组学和功能实验的结合，可以成为儿童痴呆乃至更广泛神经退行性疾病药物再利用与临床前筛选的一条可行路径。

Greenberg, Z., McDonald, E., Noreña Puerta, A. et al. Drug screen and machine learning predict neuroprotective agents in a preclinical human model of childhood dementia. Nat Commun (2026). 

https://doi.org/10.1038/s41467-026-76837-1