Nat. Commun. | AI赋能的癌细胞表面蛋白靶向微型结合蛋白发现与生化优化

AI驱动的蛋白质设计已经能够快速生成具有特定结构和潜在结合能力的全新蛋白，但从“计算得到一个高分候选”到“获得真正可用于生物医学研究或治疗的功能蛋白”之间，仍存在实验验证、表达、细胞表面运输和功能优化等关键瓶颈。研究人员建立了一套面向癌细胞表面蛋白的可扩展AI微型结合蛋白（AI-minibinder）发现流程，以PD-L1（B7-H1）、CD276（B7-H3）和VTCN1（B7-H4）为靶点，将RFdiffusion、ProteinMPNN和AlphaFold2等计算工具与哺乳动物细胞表面展示、流式细胞分选和高通量测序结合，对数千个设计进行实验筛选。结果显示，PD-L1能够获得多种高亲和力结合蛋白，而CD276和VTCN1的成功率明显较低，说明AI蛋白设计具有显著的靶点依赖性。进一步比较不同结构预测评分发现，结合ESM嵌入的Chai-1 ipTM评分与实验结合结果具有较好的对应关系，并能够识别破坏结合界面的突变。部分PD-L1微型结合蛋白被进一步开发为荧光四聚体检测试剂，在流式细胞术中达到接近商业抗体的检测效果。然而，当这些分子被整合进嵌合抗原受体（CAR）后，部分高亲和力结合蛋白却表现出较差的细胞表面运输。研究人员进一步利用遗传算法，在保持结合界面不变的情况下改造非结合表面，发现等电点（pI）是影响CAR表面表达、活性及靶标选择性的关键因素。研究表明，AI微型结合蛋白的最终可用性不仅取决于结合界面，还高度依赖非结合区域的整体生化性质。

蛋白质之间的分子识别长期以来主要依赖天然蛋白、抗体以及基于结构的人工工程。AlphaFold、RoseTTAFold以及ESMfold等模型显著提高了蛋白质结构预测能力，而RFdiffusion、AlphaProteo、BindCraft和Chroma等生成模型进一步将这一能力扩展到从头蛋白设计，使研究人员能够围绕特定靶点人工生成新的结合蛋白。微型结合蛋白通常仅由几十个氨基酸组成，相比传统抗体具有结构简单、容易生产、热稳定性高和可计算设计等优势，因此尤其适合作为检测工具或者CAR-T细胞中的抗原识别模块。

然而，计算意义上的“成功设计”并不等同于实验意义上的“可用分子”。一个预测具有高质量结合界面的蛋白还需要正确折叠、稳定表达、保持单体状态、在哺乳动物细胞中正确运输至细胞膜，并在复杂的细胞表面环境中维持特异性。研究人员因此没有仅关注如何生成更高评分的结合蛋白，而是建立从计算设计、规模化实验筛选到最终应用验证的完整流程，并选择三个同属于B7-H家族、但生物学和表面特征不同的癌症相关靶点PD-L1、CD276和VTCN1，系统研究AI设计成功率、计算评分可靠性以及结合界面之外的生化性质如何影响微型结合蛋白的实际功能。

研究人员首先利用RFdiffusion生成长度约70–88个氨基酸的多聚甘氨酸骨架，通过DSSP分析二级结构，仅保留含至少三个α螺旋的设计，再使用ProteinMPNN为骨架设计氨基酸序列，并通过AlphaFold2 initial-guess计算结合界面的pAE评分，优先保留预测质量较高的候选。随后将数百至数千个候选序列合成为寡核苷酸库，通过哺乳动物HEK293T细胞表面展示和噬菌体展示进行并行筛选，结合FACS和NGS确定富集的功能结合蛋白。获得候选后，研究人员进一步进行流式细胞术、蛋白表达和纯化、凝胶过滤、热稳定性分析以及表面等离子体共振测定，并利用Chai-1、Boltz-1和AlphaFold系列模型进行结构重新评分。部分结合蛋白被生物素化并与荧光链霉亲和素组装成四价“quattrobinder”，用于检测细胞表面靶蛋白；另一些被整合到第二代CAR中并在T细胞中评价。针对CAR表面表达不足的问题，研究人员进一步采用基于Chai-1和ESM嵌入的遗传算法，固定CD276结合界面，仅改变非界面残基，并以等电点等生化指标作为优化约束，生成并实验筛选近6000个HM9衍生变体。

研究人员发现，RFdiffusion在70–88个氨基酸范围内经常生成由两条较长α螺旋组成的发夹结构，这类设计缺乏明确的疏水核心，在初步实验中往往具有较差的表达或稳定性。相比之下，由三至四条短α螺旋组成的紧凑束状结构更适合后续实验。因此，研究人员加入二级结构过滤步骤，在进入ProteinMPNN序列设计和AF2评分之前排除少于三条α螺旋的候选。这一策略并不直接提高生成模型本身的准确性，但能够减少无效计算并提高大规模筛选效率。实验端同时建立哺乳动物细胞表面展示和噬菌体展示两种流程，使候选蛋白可以按照真实靶标结合能力进行富集和NGS定量。

图1｜AI设计微型结合蛋白的计算设计与功能筛选策略。

研究人员分别以PD-L1、CD276和VTCN1的Ig样V型结构域为设计对象。PD-L1表现出明显更高的可设计性：初始RFdiffusion结果中约22%的候选具有较好的pAE评分，而CD276和VTCN1需要尝试更多结合热点才能获得质量相近的候选。首轮约1000个设计的细胞表面筛选中，PD-L1结合阳性细胞约占2.4%，而CD276和VTCN1均低于1%；NGS同样检测到多个PD-L1富集候选、较少的CD276候选以及几乎没有VTCN1候选。噬菌体展示获得了类似趋势。

为提高较困难靶点的成功率，研究人员扩大计算设计规模，根据第一轮中表现较好的热点重新生成候选，并建立约2000个设计的改进库。第二轮筛选获得了更多CD276微型结合蛋白，同时出现少量VTCN1候选。PD-L1库中还发现了同时识别人和小鼠PD-L1的交叉反应型蛋白以及物种特异性蛋白。结果说明，即使靶点属于同一蛋白家族，AI设计成功率也可能相差很大。

图2｜B7-H家族靶点PD-L1、CD276和VTCN1微型结合蛋白的从头设计与实验筛选。

在单独验证的17个PD-L1候选中，15个能够结合人PD-L1，其中部分同时识别小鼠PD-L1。研究人员通过改变预测结合界面中的关键疏水残基验证结构模型，四个代表性结合蛋白中有三个在界面突变后几乎完全失去人PD-L1结合能力，说明计算预测界面与真实相互作用具有较好一致性。

这些蛋白在大肠杆菌中具有良好表达和单体性质，即使经历高温处理仍表现出较高稳定性。SPR进一步证实了较强结合能力：BN_286、BN_482和BN_1358对人PD-L1的解离常数分别约为227 nM、87.6 nM和2.12 nM，其中BN_1358达到低纳摩尔亲和力。值得注意的是，修改远离结合界面的表面多聚丙氨酸区域，对结合动力学仅产生较小影响。

图3｜从头设计的PD-L1 AI微型结合蛋白的结合特异性、界面验证及SPR亲和力分析。

为了判断计算评分能否进一步减少实验筛选规模，研究人员利用AF2 pAE、Chai-1 ESM ipTM和Boltz-1 ipTM重新评估候选。总体而言，获得实验验证的结合蛋白倾向于集中在计算评分较好的区域，其中Chai-1 ESM ipTM表现出最高的标准化富集能力。一个典型案例是BN_1358：AF2给予其相对一般的pAE评分，但Chai-1预测其ipTM达到0.84，而SPR实验显示其真实亲和力约为2 nM。结构比较表明，Chai-1预测了更紧凑的N端α螺旋构象，可能更接近真实结合状态。

研究人员进一步测试模型是否不仅能够给完整设计排序，还能够预测单点突变的功能影响。PD-L1四个界面突变中三个表现出明显降低的Chai-1 ipTM评分，而未完全破坏实验结合的BN_482_A57R，其计算评分同样基本保持不变。CD276的12个界面突变中有11个也表现出ipTM下降。虽然Chai-1与AF3对突变影响程度的预测并不完全一致，但二者均能够在一定程度上识别破坏性界面突变，说明结构模型可用于后续序列优化和质量控制。

图4｜不同结构预测模型的相互作用评分与AI微型结合蛋白实验成功率之间的关系。

研究人员在微型结合蛋白远离结合界面的区域引入单个半胱氨酸，进行定点生物素化，再与荧光链霉亲和素形成四价“quattrobinder”。优秀的PD-L1 quattrobinders在PD-L1过表达CHO细胞上的信号可达到商业抗体水平，并且能够检测5637膀胱癌细胞的内源PD-L1；IFN-γ诱导PD-L1升高后信号明显增强，而PD-L1敲除细胞几乎没有背景。

但这种性能并不能简单推广至所有靶点。CD276 quattrobinders虽然能够识别过表达CD276，却难以可靠检测多种肿瘤细胞中的内源蛋白；VTCN1 quattrobinders则出现较明显的非特异背景。因此，AI设计结合蛋白可以成为抗体替代工具，但必须针对每个靶点严格验证灵敏度和特异性。

图5｜PD-L1 AI微型结合蛋白组装成荧光quattrobinder后检测肿瘤细胞内源PD-L1。

研究人员将BN_1358、BN_482和BN_286等PD-L1结合蛋白整合到第二代CAR结构中。表达这些CAR的T细胞能够识别PD-L1过表达的靶细胞，同时能够区分具有内源PD-L1的癌细胞和对应的PD-L1敲除细胞，证明从头设计的AI微型结合蛋白可以直接转化为CAR的靶标识别模块。

研究人员进一步比较多个CD276微型结合蛋白CAR。虽然不同构建体的T细胞转导效率相近，但CAR表面表达差异明显，其中高亲和力对照HM9和mb的表面展示反而较差。所有CAR均可识别高表达CD276的细胞，但面对A375黑色素瘤中的内源CD276时，仅高亲和力HM9和mb能够产生明显响应。由此可见，CAR功能并不能简单由单一参数决定：高亲和力有利于识别低水平内源抗原，但高效的细胞表面运输同样不可缺少。

图6｜CD276 AI微型结合蛋白CAR揭示结合亲和力和细胞表面表达共同决定内源靶标识别。

研究人员注意到，表面表达较差的HM9和mb具有较高pI，而部分表面表达较好的自研CD276结合蛋白pI明显偏低。于是以HM9为模板，在固定CD276结合界面的同时，仅允许非结合区域发生突变，并通过遗传算法生成近6000个覆盖广泛pI范围的变体。尽管结合界面保持不变，只有约15%–17%的细胞表现出CD276阳性结合，说明非结合表面本身即可显著影响功能。

NGS进一步显示，pI约6.5–8.5的变体在CD276结合群体中明显富集，并且较少出现在低表面表达群体中。这一结果直接说明，蛋白质表面整体电荷性质能够决定CAR膜运输和表面可及性。

图7｜AI微型结合蛋白CAR的最佳细胞表面运输依赖其等电点。

研究人员将不同pI的HM9衍生变体表达于原代人T细胞，发现随着pI升高，HA标签阳性比例、CAR表面荧光强度以及归一化表面表达整体呈下降趋势。高碱性变体不仅膜表面展示较差，而且细胞群体中的表达更加不均一。

功能实验进一步表明，经过pI优化的HM9变体对CD276阳性A375细胞产生更强的IFN-γ和TNF-α反应，并表现出增强的肿瘤细胞杀伤能力，同时对CD276敲除细胞保持较低反应。相反，强碱性变体区分CD276野生型和敲除细胞的能力下降，提示过高正电荷可能增加非特异细胞表面相互作用。最终，研究人员筛选出HM9变体1_33-45等候选，证明仅通过重新设计结合界面之外的残基，就能够在不破坏抗原识别的情况下改善CAR表面表达、功能和选择性。

图8｜等电点优化提高AI微型结合蛋白CAR-T细胞的活性和靶标选择性。

这项研究的重要意义并不只是再次证明AI能够“设计出会结合的蛋白”，而是把问题推进到了更接近实际应用的一层：什么样的AI设计蛋白才真正能够成为可靠的生物医学工具。PD-L1、CD276和VTCN1之间巨大的设计成功率差异首先说明，目前的生成模型仍高度依赖靶蛋白表面性质。PD-L1可能具有更加明显和可接近的疏水相互作用区域，因此更适合RFdiffusion当前以热点为中心的设计模式，而CD276和VTCN1则更加困难。换言之，针对某一靶点获得较高实验成功率，并不能直接证明同一方法具有普遍适用性。

更关键的是，研究结果重新界定了“蛋白设计质量”。传统AI蛋白设计通常将主要优化目标放在结构置信度、结合界面和预测亲和力上，但CAR实验表明，一个具有极高结合亲和力的微型结合蛋白仍可能由于整体电荷、膜运输或表面展示不足而表现不佳。近6000个HM9变体的系统实验将这一现象具体化：保持结合界面基本不变，仅调整非界面序列即可显著改变CAR表面表达和功能，其中约6.5–8.5的pI范围表现出较好的综合性质，而过度碱性的结合蛋白往往具有更差的表面展示和更窄的靶标选择性窗口。由此，非结合界面应被视为与结合界面同样重要的第二设计空间。

研究人员也强调，所有从头设计结合蛋白都需要类似抗体的严格质量控制。理想验证体系应包含靶蛋白野生型与CRISPR敲除的同基因背景细胞，而且最好在多个独立细胞模型中重复验证，因为某些结合蛋白可能在一个模型中表现出良好特异性，却在另一个模型中产生背景信号。对于治疗应用，这一点更加重要。

目前研究仍缺少优化CAR-T细胞的体内验证。未来需要在能够评价免疫原性、正常组织抗原表达和肿瘤微环境的模型中，系统研究不同亲和力和不同pI微型结合蛋白的CAR-T细胞持久性、抗肿瘤活性以及on-target/off-tumor毒性。最高亲和力并不必然意味着最佳治疗窗口。研究人员还提出，糖基化、疏水性及其他非界面生化性质都值得在未来生成模型中直接作为设计目标。

总体而言，这项工作展示了一条从AI生成 → 大规模实验筛选 → 结构评分 → 生化表征 → 应用验证 → 非界面重新设计的闭环路线。其核心结论是：下一阶段AI蛋白设计不能只追求“预测能结合”，而需要进一步设计“能够在目标生物学环境中正常表达、运输、保持特异性并发挥功能”的蛋白。只有把结合界面与整体生化可部署性同时纳入优化目标，AI生成的微型结合蛋白才有可能真正转化为稳定的研究试剂和治疗性分子。

Broske, B., McEnroe, B.A., Frechen, S.C. et al. AI-enabled discovery and biochemical optimization of minibinders targeting cancer cell-surface proteins. Nat Commun 17, 8736 (2026). 

https://doi.org/10.1038/s41467-026-76760-5