Nat. Biotechnol. | 稀疏数据驱动的自适应模型引导蛋白进化优化紧凑型真核基因组编辑器

高效蛋白质工程受到巨大序列空间与有限实验通量的双重限制，对于缺乏大规模突变数据的新型蛋白家族尤其如此。研究人员以真核来源的紧凑型RNA引导核酸酶Fanzor2（Fz2）为对象，将同源蛋白发现、ωRNA支架工程与一种名为 EvoMax 的稀疏数据模型引导蛋白进化方法相结合。EvoMax通过迭代实验测定，将高斯过程回归（GPR）、蛋白质语言模型ESM-2和逆折叠模型ESM-IF整合起来，在有限标注数据条件下探索复杂的序列—适应度空间。最终获得的 FanzMAX v3-hLa 在最佳内源位点实现高达97%的编辑效率，在19个内源基因组位点上的平均编辑效率约为33%，比已有紧凑型编辑器enNlovFz2和enCnCas12f1提高超过2.6倍。与此同时，优化后的编辑器具有更宽的靶标邻近基序（TAM）兼容性，并保持较好的基因组特异性。EvoMax还能够恢复多个天然失活Fz2同源蛋白的功能，表明从少量实验数据中学习到的适应度规律可以在相关蛋白支架之间迁移。单AAV递送进一步在小鼠体内实现了人PCSK9靶向编辑，但高活性版本也暴露出明显的体内毒性问题。总体而言，该研究建立了一种将稀疏实验数据、机器学习和迭代实验验证相结合的蛋白进化策略，并获得了适用于哺乳动物基因组编辑的高活性紧凑型Fanzor核酸酶。

蛋白质工程是现代生物技术的重要基础，从工业酶到基因组编辑器，其核心任务都是在巨大的氨基酸序列空间中寻找具有更优功能的变体。传统理性设计依赖对结构和作用机制的深入理解，而定向进化通常需要构建大型突变文库并进行多轮高通量筛选。近年来，蛋白质语言模型、逆折叠模型以及主动学习开始用于预测突变效应，使计算模型能够帮助缩小实验搜索空间。然而，许多AI蛋白工程方法仍然依赖规模较大的任务特异性数据，而新发现的蛋白家族恰恰缺乏这样的数据基础。

Fanzor是近年来发现的一类真核RNA引导核酸酶，其中Fanzor2通常不足500个氨基酸，尺寸远小于许多经典CRISPR核酸酶，因此具有将完整编辑系统装入单个AAV载体的潜力。部分Fz2还具有较宽的TAM识别能力，但天然Fz2在未经细胞分选富集的哺乳动物细胞中通常活性有限。如何在缺乏大量实验突变数据的情况下快速提高其活性，成为Fanzor走向实用化的主要障碍。

研究人员因此提出了一条“先发现天然多样性，再优化RNA，最后通过稀疏数据驱动蛋白进化”的路线。他们首先从超过1,600个候选中寻找具有潜力的真核Fz2同源蛋白，然后优化ωRNA支架，进一步开发EvoMax，在只有数百个已测突变数据的情况下引导Fz2迭代进化，并最终评价其内源基因编辑能力和体内应用潜力。

研究人员首先通过生物信息学扩展Fz2家族，从超过1,600条Fz2样序列中筛选332个真核同源蛋白进行系统发育分析，再利用体外转录翻译、TAM文库和HEK293T细胞荧光报告系统验证候选核酸酶。针对筛选得到的NaloFz2，利用AlphaFold 3和RNAfold分析Fz2–ωRNA–DNA复合物，并通过茎环截短、GAAA四环替换和碱基配对强化获得92 nt的enωRNA。蛋白优化方面，研究人员汇集209个具有实验活性数据的单点突变，以BLOSUM62编码的GPR建立经验适应度模型，并将其与ESM-2提供的进化先验以及ESM-IF提供的结构兼容性评分结合形成EvoMax。模型首先从大规模候选突变中筛选高潜力序列，再进行结构约束重排序，每轮仅实验验证约10–20个候选，并将最佳变体作为下一轮起点。最终通过NGS测定多个内源位点的indel，通过TAM文库和预测脱靶位点测序评价靶向范围与特异性，并利用单AAV系统开展PCSK9体内编辑实验。

研究人员首先系统扩展Fz2序列空间，从超过1,600个候选中选择332个真核Fz2进行系统发育分析，并从不同进化分支挑选代表性蛋白进行实验验证。体外TAM筛选发现M7具有明显DNA切割活性，并偏好5′-CCG-3′ TAM。进一步分析M7相关分支后，研究人员确定了来自 Naegleria lovaniensis 的NaloFz2，其同样具有明确的体外切割能力和5′-CCG-3′ TAM偏好。

序列比较揭示了一个关键结构特征：催化RuvC区域和DNA结合区域相对保守，而约100个氨基酸的N端结构域（NTD）差异明显。具有完整NTD的候选能够检测到DNA切割，而NTD截短或缺失的候选基本失活。在HEK293T细胞中，NaloFz2的编辑活性明显高于M7；仅删除NaloFz2 N端20–30个氨基酸就足以使编辑能力消失，说明完整NTD是Fz2功能的重要结构基础。研究人员认为，它更可能参与蛋白结构稳定和核糖核蛋白复合物组装，而不仅仅发挥核定位作用。

图1｜真核Fanzor2同源蛋白的系统筛选、TAM识别及N端结构域对基因组编辑活性的影响。

尽管NaloFz2具有完整NTD，其天然编辑效率仍然有限，因此研究人员进一步优化其ωRNA。结构预测显示，天然120 nt ωRNA包含三个主要茎环，其中远端区域较为柔性，与蛋白接触有限。系统修改表明，SL3是最适合工程化的区域：用GAAA四环替换远端环并进一步截短SL3能够明显增强编辑活性，而SL2截短影响较小。

在此基础上，研究人员通过增强剩余螺旋中的碱基配对稳定性，获得两个仅92 nt的优化支架enωRNA v1和v2。它们只有天然ωRNA约四分之三的长度，却具有明显更高的编辑活性。尤其是enωRNA v2不仅适用于NaloFz2，还使M7活性提高8.7倍，并在使用NaloFz2 NTD替换截短NTD后恢复了原本失活的M9功能，说明优化RNA支架具有一定的跨同源蛋白可迁移性。

研究人员还注意到Fz2紧凑结构对ωRNA 3′端保护有限，因此测试了不同La RNA结合蛋白融合策略。将人La蛋白（hLa）融合至NaloFz2 C端能够进一步提高编辑效率，由此形成了后续FanzMAX系统“核酸酶优化+ωRNA工程+La融合”的多层设计框架。

图2｜基于结构的ωRNA支架工程以及La蛋白融合对Fz2基因组编辑活性的增强。

针对缺少大规模Fz2突变数据的问题，研究人员建立EvoMax。其初始训练集仅包含209个具有实验活性测量值的单点突变，其中同时利用了与NaloFz2进化和功能相关的NlovFz2数据，以实现跨同源蛋白的迁移学习。

在比较多种监督学习算法后，基于BLOSUM62编码的GPR表现最好，R²达到0.693，均方根误差为0.232。EvoMax并未完全依赖这个小数据模型，而是进一步引入650M参数的ESM-2，以蛋白语言模型学习到的进化规律补充实验数据；随后利用ESM-IF评估候选突变与AlphaFold预测结构的兼容性。

因此，EvoMax实际上整合了三类互补信息：GPR负责回答“已有实验数据提示哪些突变可能有效”，ESM-2提供蛋白进化空间中的先验知识，ESM-IF则限制突变不能严重破坏结构。随着迭代推进，三者权重动态改变，使早期优化更依赖实验数据，而后期逐渐增加进化和结构信息，从已经优化的局部区域向更远序列空间探索。

图3｜EvoMax稀疏数据蛋白进化框架及GPR、ESM-2和ESM-IF的分层整合策略。

研究人员连续开展三轮NaloFz2优化，每轮只选择10–20个高排名候选进行实验验证，并使用上一轮最佳变体作为下一轮起点。随着优化深入，模型逐渐降低对初始GPR经验模型的依赖，提高ESM-2和ESM-IF贡献，从局部优化转向更加广泛的序列探索。

这种小规模迭代筛选取得了较高命中率。第一轮中，EvoMax推荐突变有84%表现为功能性变体，而在相同起始背景下，EVOLVEpro和AiCE分别为20%和35%。三轮最佳变体依次命名为FanzMAX v1、v2和v3，其活性逐步增加。当FanzMAX v3与enωRNA v2组合时，报告系统活性较天然NaloFz2+天然ωRNA提高超过13倍。模型预测分数与三轮实验结果之间存在中等但显著的正相关，说明即使训练数据十分有限，组合模型仍然捕获到了具有实验意义的适应度信息。

在真实内源位点中，多层工程的贡献更加清楚。CXCR4位点上，天然NaloFz2产生约12%的indel，FanzMAX v3提高至66%，再加入C端hLa后达到约97%。ωRNA优化、蛋白序列进化和hLa融合分别贡献了逐步的性能提升。部分有益突变分布于WED、RuvC以及潜在DNA结合区域，提示EvoMax可能通过改善DNA接触和催化核心稳定性增强核酸酶活性。

图4｜EvoMax三轮自适应模型引导进化获得FanzMAX v1–v3及其逐步增强的基因组编辑活性。

研究人员进一步提出一个更具挑战性的问题：从NaloFz2学习到的规律能否迁移到其他Fz2，甚至恢复天然失活蛋白的功能？

他们首先将NaloFz2完整NTD移植到NTD截短或高度分化的失活Fz2中，建立结构上更允许发挥功能的嵌合支架，再使用enωRNA v2并通过EvoMax寻找潜在有益突变。模型重点分析失活蛋白与高活性Fz2之间高度分化的10–30个位点，每个同源蛋白仅引入2–5个优先级最高的突变。

这一策略恢复了多个同源蛋白的可检测编辑活性，其中M2、M5和M8效果最明显。恢复后的M2和M3进一步接受第二轮EvoMax优化，G298A和I368L等突变分别带来约1.9倍和2.5倍活性提升。整个恢复和优化过程中，约55%–70%的模型推荐变体优于对应亲本。

这一结果表明，EvoMax学习的并非完全局限于某一个NaloFz2序列的经验规律，而至少有部分Fz2家族层面的适应度约束能够跨支架迁移。这一点对于缺乏实验数据的新蛋白家族尤其重要：少量高质量数据可能不仅能够优化一个蛋白，还能够成为整个相关蛋白家族的工程起点。

图5｜EvoMax通过NTD结构域移植和模型引导突变恢复并进一步优化天然失活的Fz2同源蛋白。

最终获得的FanzMAX v3-hLa在多个真实基因组位点上进行了系统评价。在CXCR4、VEGFA、EMX1、PCSK9和DMD等靶点中，其总体活性均高于天然NaloFz2以及紧凑型编辑器enNlovFz2和enCnCas12f1。扩展到19个内源位点后，FanzMAX v3-hLa平均编辑效率约为33%，而enNlovFz2和enCnCas12f1分别约为11%和12.5%，天然NaloFz2仅约3.4%。因此，FanzMAX相较天然系统提高约10倍，相较已有工程化紧凑编辑器提高约2.7倍。

优化还改变了靶向范围。天然NaloFz2具有较严格的TAM偏好，而FanzMAX v3-hLa能够兼容ACAG、ACTG和AATG等更多5′-ANNG序列。脱靶分析显示，在CXCR4位点达到约97%在靶编辑时，大多数检测的候选脱靶位点低于1%；在PCSK9位点达到约67%在靶编辑时，检测到的脱靶位点均不超过约0.3%。

Fz2不足500个氨基酸的紧凑尺寸进一步允许构建单AAV编辑系统。在HuH-7细胞中，研究人员针对PCSK9逐步开发AAV 1.0、2.0和3.0，其中部分优化版本实现约50%–68%的编辑效率。体内实验中，3.7 kb的AAV 1.0在小鼠肝脏产生约25%的编辑，并使循环PCSK9水平降低约34%，且未检测到明显毒性。

但一个重要结果是，活性更强并不意味着体内效果更好。更高效的AAV 2.0和3.0在系统给药后7–14天内导致快速发病。进一步分析发现，高活性构建体产生了更多大型基因组缺失，提示过强核酸酶活性和DNA损伤可能造成肝细胞毒性。因此，治疗性编辑器优化的最终目标不能简单定义为“编辑效率最大化”，还必须寻找活性与安全性之间的窗口。

图6｜FanzMAX v3-hLa的多位点内源基因组编辑、TAM扩展、特异性分析以及单AAV介导的体内PCSK9编辑。

这项研究最值得关注的并不仅是获得了一个更高效的Fanzor编辑器，而是展示了如何在数据极度稀缺的情况下开展AI引导蛋白进化。许多蛋白质机器学习方法建立在大规模深度突变扫描数据之上，但对于刚刚发现的蛋白家族，这些数据通常不存在。Fz2正是这种典型场景：天然蛋白数量有限、实验通量受哺乳动物细胞体系限制，也缺少成熟的序列—功能数据库。

EvoMax没有试图用209个突变数据训练一个复杂深度神经网络，而是将不同来源的信息组合起来。GPR从有限实验数据中学习局部适应度规律，ESM-2提供从大规模天然蛋白序列中学习到的进化先验，ESM-IF则利用三维结构限制不合理突变。更重要的是，这三类信息的权重不是固定不变：早期更相信实验数据进行局部优化，随着迭代推进逐渐增加语言模型和结构模型贡献，从而扩大探索范围。这种“实验—模型—实验”闭环可能比一次性预测整个序列空间更适合低数据蛋白工程。

研究也说明，高性能基因组编辑器并不能仅靠优化核酸酶蛋白获得。FanzMAX最终性能来自多个层面的协同：完整NTD维持Fz2结构和核糖核蛋白组装；enωRNA改善RNA支架稳定性；EvoMax寻找提高蛋白活性的突变；C端hLa进一步稳定RNA相关结构。也就是说，最终97%的编辑效率并不是单纯AI蛋白设计的结果，而是蛋白、RNA和融合结构域协同工程的结果。

EvoMax能够恢复多个失活Fz2同源蛋白同样具有方法学意义。这意味着一个蛋白支架产生的少量实验数据可能被迁移到同一家族的其他成员，使天然进化过程中已经失活或活性极低的蛋白重新进入可工程化空间。不过，这种迁移能力目前主要在Fz2家族内部得到证明。随着序列差异进一步增加，模型还能否有效迁移，以及是否能够扩展至完全不同的蛋白家族，仍需进一步验证。

方法本身也存在明确限制。EvoMax目前主要在单点突变层面进行预测，并没有显式建模高阶上位性；多个突变之间的组合效应主要通过逐轮实验叠加获得。因此，当蛋白功能依赖复杂的非加性突变组合时，其搜索效率可能受到限制。此外，模型性能仍依赖初始实验数据质量以及目标蛋白与已有训练支架之间的进化距离。

更值得重视的是体内实验揭示的安全性边界。AAV 1.0实现约25%的肝脏编辑和34%的循环PCSK9降低，并维持较好的耐受性；然而更强的AAV 2.0和3.0却出现急性毒性。高活性版本伴随更多大型基因组缺失，提示过度提高核酸酶活性可能造成不可接受的DNA损伤。这一结果实际上改变了AI蛋白优化的目标定义：对于治疗性基因编辑器，适应度函数不应只是最大化编辑效率，而应同时考虑编辑强度、修复产物分布、脱靶效应和细胞毒性。

总体而言，该研究构建了一条从天然同源蛋白发现 → RNA结构工程 → 稀疏数据建模 → 自适应蛋白进化 → 跨支架功能恢复 → 内源编辑 → 体内验证的完整路线。它表明AI蛋白工程并不一定需要数万乃至数百万条实验标签；通过合理结合少量实验数据、蛋白语言模型、结构先验和迭代验证，即使只有数百个标注突变，也可以有效导航巨大的蛋白序列空间。与此同时，体内结果进一步提醒，下一阶段模型引导的基因组编辑器进化需要从单纯追求“更高活性”，转向同时优化“活性、靶向范围、编辑产物和安全性”的多目标设计。

Wan, S., Gold, J., Vure, P. et al. Adaptive model-guided protein evolution with sparse data optimizes compact eukaryotic genome editors. Nat Biotechnol (2026). 

https://doi.org/10.1038/s41587-026-03272-4