转自公众号: 吕华课题组

大家好，今天给大家分享一篇近期发表在Angewandte Chemie International Edition上的文章，题为：Active Learning-Accelerated Discovery of Antifungal Polymers With Self-Assembly Capacity for Tackling Invasive Fungal Diseases。该工作的通讯作者是来自浙江大学的王幽香和金桥。


侵袭性真菌病（invasive fungal diseases，IFD）是致病真菌侵入深部组织、内脏或血液引起的系统性感染，致死率高，是全球公共卫生的严峻威胁，其中白色念珠菌（Candida albicans）是最常见的致病真菌之一。现有抗真菌药物不仅容易诱发耐药，毒副作用也较为突出；而真菌形成生物膜后，由于药物难以渗透且易被酶降解，疗效会进一步减弱。


抗真菌肽（antifungal peptides，AFPs）是一种充满前景的抗真菌药物，但其存在易被蛋白酶降解、成本高、难以规模化制备等短板。因此，模拟AFP的聚合物成为更有前景的替代方案——它们不仅更稳定、可批量制备，其两亲性结构还可能自发组装成纳米颗粒，用于递送传统抗真菌药。不过，聚合物的单体种类、配比、分子量等参数繁多，单靠传统试错法很难高效锁定高性能结构。


针对这一难题，作者构建了主动学习驱动的智能平台PolyCAML（图1），将仿生分子设计、自动化高通量合成与表征以及机器学习整合在一起，设计了由两种阳离子单体、一种疏水单体和一种亲水单体组成的四元共聚物虚拟库（图1A），涵盖高达516114种组合。借助“设计–构建–测试–学习”（DBTL，图1B）的闭环流程，作者以最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）衡量抑菌活性，以20 %溶血浓度（maximum polymer concentration causing 20 % hemolysis, HC20）衡量生物相容性，在短短18天内完成3000个聚合物的自动合成与双重评价，筛出11个兼具强抗真菌活性（MIC ≤ 4 µg/mL）和良好生物相容性（HC20 ≥ 2048 µg/mL）的候选聚合物，并通过体外和体内实验验证了其中4个性能最优的抗真菌聚合物（P4–P7，图4D）的抑菌效果和生物相容性。

图1  AI驱动的抗真菌聚合物高通量筛选平台。


面对高质量标注数据稀缺的问题，作者构建了一个基于图的聚合物基础模型（图2A）。他们把每个共聚物组分建模为独立子图，用一个全局虚拟节点连接所有组分以整合整体结构信息，再用四个分别连接四种单体的虚拟节点把各单体的投料比例定量编码进图拓扑；随后，图变换器（Graph Transformer）提取每个节点的结构特征，经读出（readout）整合成代表整条聚合物的单一向量，再由投影头（projection head）输出抗真菌活性与生物相容性的预测值。该模型先在一百万个无标签聚合物结构上自监督预训练以掌握化学结构的规律，在此基础上以500个随机样本为种子集（图2B, C），进入“设计–构建–测试–学习”的循环，即由模型推荐候选结构后，通过PET-RAFT聚合在自动化合成平台iChemFoundry上批量制备，再高通量测定其MIC与HC20，并把结果回馈模型继续优化。结合贪婪算法，经四轮主动学习迭代，抗真菌性能与生物相容性两个目标逐步收敛（图2E）。与随机森林（RF）、XGBoost相比，经过预训练的图变换器在预测精度与泛化能力上都更优（图2D），不会因样本稀少而在少数高性能样品上过拟合。

图2  模型训练框架与迭代优化过程。


为探究重要的影响因素，作者用SHAP进一步拆解了各分子描述符的贡献。结果发现，拓扑极性表面积（tPSA）、摩尔溶解度（log S）、阳离子单体的间隔基碳数以及疏水单体的clog P，是决定抗真菌效力与生物相容性的关键因素（图3D, E）。作者认为，tPSA过高会增强分子极性与水合能力，在真菌膜表面形成致密水化层，妨碍聚合物吸附到膜上，同时加剧与红细胞的非特异极性作用而升高溶血风险；log S越高，水溶性越好，越能防止分子聚集、充分接触真菌，从而有利于抗真菌活性；clog P越高，疏水性越强，越容易插入红细胞脂膜、破坏其完整性，因此会降低生物相容性；而阳离子单体的间隔基碳数则呈复杂的双重调控——适中的间隔基能增强构象柔性、优化两亲性平衡，让阳离子电荷充分暴露，从而兼顾抗真菌性能与生物相容性。这些规律为后续理性设计抗真菌聚合物提供了更明确的指引。

图3  结构演化分析与关键描述符解读。


作者接下来通过体外实验验证其杀菌能力和生物安全性。作者首先进一步测定了11个候选聚合物的最低杀菌浓度（minimum fungicidal concentration, MFC）和对小鼠成纤维细胞L929的半抑制浓度（50 % inhibitory concentration, IC50），筛出4个选择性指数（IC50/MFC）最高的聚合物P4–P7（MFC ≤ 8 µg/mL、IC50 ≥ 512 µg/mL）用于后续实验。基于NPN的外膜通透性实验（图4E）、基于DiSC3(5)的细胞质膜去极化实验（图4F）和K⁺泄漏实验（图4G）均表明真菌膜的完整性被破坏，电镜（SEM/TEM，图4H, I）也直接观察到膜皱缩、表面裂纹和胞内物质泄漏。这种破膜式杀菌在4倍MFC条件下1小时即可杀灭99.9 %以上的白色念珠菌，相比之下，传统抗真菌药氟康唑（FCZ）1小时仅杀灭约10 %（图4K）。此外，这四种聚合物极难产生耐药性，连续传至100代后MIC几乎不变，而FCZ的MIC则提高了32倍（图4L）。此外，聚合物对茄病镰刀菌和烟曲霉菌也有一定的杀菌效果，具有一定的广谱性。

图4  目标聚合物对浮游白色念珠菌的体外抗菌活性及作用机制。


得益于两亲性结构，P4–P7能在水溶液中自发组装成约100 nm、表面带正电荷的纳米颗粒（图5A, B），这有利于穿透表面带负电的致密真菌生物膜。作者把尼罗红或抗真菌药氟康唑（FCZ）包载进纳米颗粒（图5C, D），共聚焦成像显示NR@NPs能从生物膜表面渗入深层（图5C, F）；抗生物膜测试中，游离FCZ的生物量减少不足7 %，空白纳米颗粒约80 %，而FCZ@NPs在等浓度下达93 %（图5E, G），展现出显著的协同抗生物膜效果。

图5  FCZ负载纳米颗粒的体外抗生物膜性能评价。


完成体外实验评价后，作者通过体内实验进一步探究其抗真菌效果与生物相容性。候选聚合物静脉注射后血浆生化与电解质指标均正常，表明其生物安全性良好。在小鼠白色念珠菌诱导的真菌血症模型中（图6A），静脉给予P4–P7（50 mg/kg）后，心、肝、脾、肺、肾的真菌载量较盐水组降低2.4–3.7个数量级，疗效达到甚至超过FCZ（图6B），炎症指标（白细胞与中性粒细胞）也恢复至接近正常（图6C, D）；7天生存率达100 %（FCZ为83 %、盐水组不足20 %，图6F），体重同步恢复至健康水平（图6G）。

图6  目标聚合物在小鼠真菌血症模型中的体内疗效。


针对典型的生物膜相关感染，作者又建立了小鼠真菌性角膜炎模型（图7A），局部给予FCZ@NPs（0.5 mg/kg，连续3天）。FCZ@NPs使角膜真菌数量较盐水组降低约3个数量级（图7D），临床评分明显下降（图7C）；中央角膜厚度由约155 µm恢复正常（约77 µm，图7F, G），裂隙灯（图7B）、荧光素钠染色（图7E）及H&E/PAS组织学（图7I, J）均显示角膜上皮连续完整、基质致密规则、基底膜完好，疗效显著优于游离FCZ。

图7  FCZ@NPs在小鼠真菌性角膜炎模型中的体内疗效。


综上所述，本工作建立了通用的主动学习加速智能平台PolyCAML，通过DBTL闭环，作者在18天内从51万余种组合中高效筛选出兼具强抗真菌活性、良好生物相容性与自组装载药能力的聚合物，并在全身真菌血症与真菌性角膜炎两种体内模型中验证了优异疗效。该平台采用模块化架构，可灵活替换单体构建单元、预测任务与实验表征流程，有望拓展至抗氧化、组织黏附等其他功能聚合物的高通量发现，为功能高分子材料的智能化研发开辟了通用化道路。


作者：ZZZ

DOI: 10.1002/anie.3008697

Link: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.3008697


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